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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-213119

Resumo

O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito do extrato aquoso de Justicia insularis (JI) como fitormônio e como antioxidante sobre o cultivo in vitro de folículos pré-antrais (primordiais, primários e secundários) ovinos (in situ e/ou isolados). Para isso, o estudo foi dividido em três fases, a saber: Fase I Cultivo dos folículos presentes em fragmentos ovarianos (FO) ou cultivo in situ; Fase II - Cultivo de folículos secundários (FS) isolados e Fase III Cultivo de folículos pré-antrais em dois passos, isto é, in situ (passo 1) e isolados (passo 2). Na Fase I, em um primeiro experimento, FO foram cultivados por 7 dias na presença de FSH (50 ng/mL) ou de JI em diferentes concentrações (0,3; 1,25 ou 5 mg/mL). No segundo experimento, os FO foram cultivados na presença de FSH (50 ng/mL) + anetol (300 g/mL) ou de JI (0,3 mg/mL) + anetol (300 g/mL). Em ambos os experimentos, FO frescos foram utilizados como controle e foram avaliados os seguintes parâmetros: sobrevivência, ativação e crescimento folicular; níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs - experimento 1) e a densidade de células do estroma (experimento 2). Na Fase II, FS foram cultivados por 18 dias na presença de FSH (100 ng/mL) ou de JI em diferentes concentrações (0,3; 1,25 ou 2.5 mg/mL). Ao final do cultivo foram avaliados, a morfologia, sobrevivência e crescimento folicular; antro e níveis de EROs. Complexos cumulus oócito foram maturados para avaliação da cromatina e as paredes foliculares foram analisadas quanto à expressão de RNAm para glutationa peroxidase, Kit ligand, cyclina B1 e a hialuronano sintase 2. Na Fase III, FO foram cultivados por 7 dias (passo 1), em seguida, FS foram isolados desses FO e cultivados por 6 dias (passo 2). Em ambos os passos, o meio de cultivo foi suplementado com JI (0,3 mg/mL). Além dos parâmetros já mencionados, foi avaliada também a capacidade antioxidante total (passo 1) e a distribuição e atividade mitocondrial (passo 2). Na Fase I, a JI 0,3 mg/mL manteve a porcentagem de folículos morfologicamente normais semelhante ao controle. O uso de JI e anetol aumentou os níveis de EROs. Na Fase II, a taxa de antro com a JI 0,3 mg/mL foi maior (P < 0,05) do que nos demais tratamentos. Além disso, a taxa de oócitos viáveis nesse tratamento foi superior (P < 0,05) à observada com FSH. Os níveis de EROs e a expressão gênica não foram influenciados pelos tratamentos, em relação ao controle. Na Fase III, a JI 0,3 mg/mL aumentou o potential antioxidante, promoveu a ativação e crescimento folicular nos FO, bem como promoveu o desenvolvimento dos FS isolados. De acordo com os resultados, conclui-se que, o extrato aquoso de JI pode ser utilizado como um suplemento alternativo ao FSH, no meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais ovinos, seja em um sistema simples ou em um sistema de dois passos.

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The objective of the present work was to evaluate the effect of the aqueous extract of J. insularis (JI) as phytohormone and as an antioxidant on the in vitro culture of preantral (primordial, primary and secondary) ovine follicles (in situ and/or isolated). For this, the study was divided into three phases, namely: Phase I - Culture of follicles present in ovarian fragments (OF) or in situ culture; Phase II - Culture of isolated secondary follicles (SF) and Phase III - Culture of preantral follicles in two steps, that is, in situ (step 1) and isolated (step 2). In Phase I, in a first experiment, OF were cultured for 7 days in the presence of FSH (50 ng/mL) or JI at different concentrations (0.3, 1.25 or 5 mg/mL). In the second experiment, OF were cultured in the presence of FSH (50 ng / mL) + anethole (300 g/mL) or JI (0.3 mg/mL) + anethole (300 g/mL). In both experiments, fresh OF were used as the control and following parameters were evaluated: survival, activation and follicular growth; levels of reactive oxygen species (ROS - experiment 1) and stromal cell density (experiment 2). In Phase II, SF were cultured for 18 days in the presence of FSH (100 ng/mL) or JI at different concentrations (0.3, 1.25 or 2.5 mg/mL). At the end of the culture, morphology, survival and follicular growth, antrum formation and ROS levels were evaluated. Oocyte cumulus complexes were matured for chromatin evaluation, and follicular walls were analyzed for mRNA expression for glutathione peroxidase, kit ligand, cyclin B1 and hyaluronan synthase 2). In Phase III, OF were cultured for 7 days (step 1), then SF were isolated from these OF and cultured for 6 days (step 2). In both steps, the culture medium was supplemented with JI (0.3 mg/mL). In addition to the previously mentioned parameters, total antioxidant capacity (step 1) and mitochondrial distribution and activity (step 2) were also evaluated. In Phase I, 0.3 mg/mL JI maintained the percentage of morphologically normal follicles similar to the control. The use of JI and anethole increased levels of ROS. In Phase II, the rate of antrum formation with 0.3 mg/mL JI was higher (P < 0.05) than in the other treatments. In addition, the rate of viable oocytes in this treatment was higher (P < 0.05) than that observed with FSH.. In Phase III, 0.3 mg/mL JI increased the antioxidant potential, promoted follicular activation and growth in OF, as well as promoted the development of isolated SF. According to the results, it is concluded that the aqueous extract of JI can be used as an alternative supplement to FSH in the in vitro culture medium of ovine preantral follicles, either in a single or in two steps system.

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