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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-213122

Resumo

A criopreservação do tecido testicular apresenta-se como única alternativa para preservação do material genético de animais machos pré-púberes, sejam eles humanos, domésticos ou selvagens que tenham sido submetidos a tratamentos gonadotóxicos ou ido a óbito precocemente. Entretanto, este campo de pesquisa ainda se encontra em fase de experimentação para elaboração de protocolos que viabilizem o emprego desta biotecnologia reprodutiva nos programas de reprodução artificial. Assim, o objetivo geral desta pesquisa foi avaliar a influência da vitrificação na estrutura, atividade metabólica, composição e funções celulares do tecido testicular de gatos pré-púberes utilizando diferentes técnicas de vitrificação, associações de crioprotetores, métodos de aquecimento e condições de reanimação tecidual. Na etapa 1, pares testiculares obtidos de animais com idade entre 3-5 meses após orquiectomia bilateral eletiva foram divididos em fragmentos de aproximadamente 1-3mm3. Em seguida, os fragmentos foram avaliados a fresco quanto à morfologia, o potencial de proliferação celular e viabilidade celular ou alocados em uma das associações de crioprotetores a serem testadas (dimetilsulfóxido (DMSO) / glicerol (GLI); etilenoglicol (EG) / GLI ou DMSO / EG) e submetidos à vitrificação por superfície sólida (VSS) ou em criotubos (VCT). Após aquecimento dos fragmentos em banho maria a 37 °C durante 1 minuto, os mesmos foram submetidos às mesmas avaliações do grupo controle. A associação de crioprotetores composta por DMSO / GLI propiciou uma melhor conservação das estruturas teciduais, assim como a manutenção do potencial de proliferação celular e da viabilidade celular utilizando a técnica de VSS ou VCT. Na etapa 2, fragmentos testiculares foram submetidos à VSS utilizando a associação de crioprotetores DMSO/GLI e posteriormente aquecidos em banho maria a 37 °C durante 1 minuto ou a 50 °C durante 5 segundos. Em seguida, os fragmentos foram mantidos em cultivo in vitro durante 24 horas e 5 dias em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 a uma temperatura de 38,5 °C. Os fragmentos foram avaliados quanto à estrutura, atividade metabólica, viabilidade, fragmentação de DNA e composição de células pré-meióticas e meióticas a fresco, após a vitrificação, 24 horas e 5 dias após o cultivo. Os fragmentos aquecidos a 50 °C durante 5 segundos apresentaram uma melhor qualidade estrutural, assim como elevada atividade mitocondrial após a vitrificação e 24 horas de cultivo. Ainda, após 5 dias de cultivo, o tecido testicular aquecido a 50 °C apresentou um elevado índice de células viáveis com DNA intacto, assim como a manutenção da população de células pré-meióticas e meióticas necessárias à progressão da espermatogênese. Foi possível evidenciar que o tecido testicular de gatos domésticos pré-púberes consegue manter a qualidade necessária para futura utilização nos programas de reprodução artificial após ser submetido à vitrificação e cultivo in vitro. Ademais, foram obtidos avanços nos protocolos de vitrificação e aquecimento de fragmentos testiculares que podem contribuir para um melhor aproveitamento do tecido testicular de crianças submetidas a tratamentos oncológicos, assim como do material biológico de espécies felinas mantidos em biobancos.

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The testicular tissue cryopreservation is the only alternative to preserve the genetic material of prepubertal male animals, whether human, domestic or wild that had been submitted to gonadotoxic treatments or died unexpectedly. However, this research area is still in experimentation for the elaboration of protocols that make viable the application of this reproductive biotechnology in the artificial reproduction programs. Thus, the general aim of this project was to evaluate the influence of vitrification on the structure, metabolic activity, composition and cell function of testicular tissue from prepubertal cats using different vitrification techniques, cryoprotectant associations, warming methods and conditions for tissue reanimation. In the step 1, testicular pairs obtained from animals with 3-5 months after bilateral orchiectomy were cut in pieces of approximately 1-3mm3. Then, they were submitted to fresh evaluation of morphology, cell proliferation potential and cell viability or placed in one of the cryoprotectant associations to be tested (dimethylsulphoxide (DMSO) / glycerol (GLY); ethylene glycol (EG) / GLY or DMSO / EG) and submitted to solid surface vitrification (SSV) or vitrification in cryotubes (VCT). After warming process in water bath at 37 °C for 1 minute, they were submitted to the same evaluations of control group. The cryoprotectant association of DMSO / GLY provided a better preservation of tissue structures, as well as the cell proliferation potential maintenance and cell viability using the SSV or VCT. In the step 2, testicular pieces were submitted to SSV using the cryoprotectant association DMSO /GLY and then warmed in water bath at 37 °C for 1 minute or at 50 °C for 5 seconds. After, the pieces were maintained in vitro culture for 24 hours and 5 days in a humidified atmosphere of 5% CO2 at 38.5 °C. The tissue biopsies were evaluated for structure, metabolic activity, viability, DNA fragmentation and composition of pre-meiotic and meiotic cells for fresh tissue, after vitrification, 24 hours and 5 days after culture. The pieces warmed at 50 °C for 5 seconds showed a better structural quality, as well as higher mitochondrial activity after vitrification and 24 hours of culture. Furthermore, after 5 days of culture the tissue warmed at 50 °C showed higher viable cells with intact DNA, as well as the maintenance of pre-meiotic and meiotic cells that are necessary to the spermatogenesis progression. It was possible to show that the testicular tissue of prepubertal domestic cats maintain the necessary quality for future applications in the artificial reproductive programs after tissue submission of vitrification and in vitro culture. Furthermore, advance for vitrification and warming protocol of testicular tissue was obtained, which may contribute for a better use of testicular tissue from children submitted to oncological treatments, as well as the biological material from feline species maintained in biobanks.

Biblioteca responsável: BR68.1