Comparação do potencial condrogênico de células-tronco mesenquimais de líquido sinovial, medula óssea e tecido adiposo de equinos

RESUMO

As células-tronco mesenquimais (CTMs) representam uma terapia promissora no tratamento das enfermidades articulares dos equinos. As características de imunomodulação e possível efeito regenerativo as qualificam para essa finalidade. Entretanto, ainda não foi estabelecida qual fonte de CTMs é a mais indicada para originar estrutura cartilagínea hialina em processos de regeneração. Estudos que comparem propriedades da qualidade condrogênica das diferentes fontes permanecem escassos. Este estudo comparou a qualidade condrogênica das CTMs derivadas de líquido sinovial (CTMs-LS), medula óssea (CTMs-MO) e tecido adiposo (CTMs-AD) de equinos, por meio da avaliação da síntese de agrecam produzido por condrócitos diferenciados. Para tanto, 10 cavalos foram doadores de líquido sinovial (LS), medula óssea (MO) e de tecido adiposo (AD). As CTMs foram extraídas dessas três fontes, cultivadas e diferenciadas em condrócitos a partir de duas metodologias. No primeiro método utilizou-se cultura em pellets dentro de tubos cônicos, resultando em esferoides. O segundo método foi feito a partir da magnetização das células, com a formação de cultura tridimensional, originando microesferoides. A diferenciação condrogênica foi induzida com meio comercial (StemPro chondrogenesis differentiation kit Thermo Fisher Scientific) em ambos os métodos. Após o tempo de indução condrogênica, os esferoides e microesferoides foram incubados com hidrocloreto de guanidina (GuHCl) para extração de proteoglicanos. A concentração de agrecam foi quantificada por ELISA com anticorpo primário anti-agrecam monoclonal de cavalo para os esferoides e microesferoides. Como fator de correção as proteínas solúveis foram quantificadas pelo método BCA. Immunobloting foi realizado para identificar agrecam e queratam sulfato nos esferoides. Já a identificação do agrecam e queratam sulfato nos microesferoides foi demonstrada com o emprego de imunofluorescência por meio de microscopia de alta resolução confocal. As células em cultura, oriundas das diferentes fontes, demonstraram capacidade de aderência ao plástico e aparência fibroblastoide, confirmando característica e morfologia de CTMs. Ambas as metodologias proporcionaram diferenciação condrogênica. As concentrações das proteínas solúveis e agrecam foram maiores nos esferoides oriundos das CTMs-MO em comparação aos de CTMs-AD (P < 0.05) e as CTMs-LS não denotaram diferença estatística entre as duas fontes (P > 0.05). (Proteínas solúveis CTM-MO 4.99±0.86; CTM-LS 4.14±1.03; CTM-AD 2.17±0.52) (Agrecam CTM-MO 78.13±16.3; CTM-LS 63.8±25.11; CTM-AD 26.63±9.85). No entanto, as concentrações das razões agrecam/proteínas solúveis não apresentaram diferença estatística entre fontes (P > 0.05). (Agrecam/proteína solúvel CTM-MO 25.14±11.62; CTM-LS 11.3±2.9; CTM-AD 14.2±6.81). O peso úmido dos esferoides foi maior nas CTMs-MO em comparação aos de CTMs-AD (P < 0.05) e as CTMs-LS não denotaram diferença estatística entre as duas fontes, contudo, a razão entre proteína solúvel por peso úmido e agrecam por peso úmido não demonstraram diferença significativa (P > 0.05). (Peso úmido do esferoide CTM-MO 9.79±2.4; CTM-LS 8.57±2.7; CTM-AD 5.17±3.5; Razão proteína solúvel/peso úmido CTM-MO 63.84±29.74; CTM-LS 32.66±4.07; CTM-AD 50.82±7.61; Razão agrecam/peso úmido CTM-MO 1.01±0.47; CTM-LS 0.32±0.07; CTM-AD 0.78±0.43). Agrecam e queratam sulfato foram identificados nos esferoides oriundos das três fontes, demonstrados pela técnica de Immunobloting. Nos microesferoides, as concentrações de proteínas solúveis foram maiores naqueles derivados de CTMs-AD em comparação às de CTMs-LS e CTMs-MO (P < 0.05). (Proteína solúvel CTM-MO 27.7±2.57; CTM-LS 22.02±1.84; CTM-AD 35.22±2.82). Já as concentrações de agrecam foram superiores nos microesferoides derivados de CTMs-LS em relação às CTMs-MO e não diferiram estatisticamente das CTMs-AD (Agrecam CTM-MO 63.06±12.07; CTM-LS 141.21±25.49; CTM-AD 117.14±14.32). A razão do agrecam por proteínas solúveis diferiu estatisticamente, demonstrando superioridade das CTM-LS e CTMs-AD ao comparar com as CTMs-MO (Razão agrecam/proteínas solúveis CTM-MO 4.11±1.51; CTM-LS 8.15±1.62; CTM-AD 4.23±0.7). Os microesferoides de todas as fontes expressaram agrecam e queratam sulfato por imunofluorescência confocal. Conclui-se que as CTMs derivadas das três fontes produzem agrecam. Os esferoides de CTMs-AD produzem menor rendimento, mas desempenham eficiência igual às de CTMs-LS e CTMs-MO, confirmados pelas razões de agrecam por proteínas solúveis. Já em ambiente tridimensional, as CTMs-LS e CTMs-AD demonstram superioridade condrogênica. Por fim, as três fontes podem ser utilizadas em tratamentos intra-articulares, já em conjunto com biomateriais ou scaffolds deve-se recomendar a utilização de CTMs-LS ou CMTs-AD.

ABSTRACT

Mesenchymal stem cells (MSCs) represent a promising therapy for treatment of joint disorders in horses. They are qualified for this purpose because of the immunomodulation characteristics and possible regenerative effect. However, it has not yet been established which source of MSCs is the most indicated to create hyaline cartilage structure in regeneration processes. Studies that compare properties of chondrogenic quality from different sources remain scarce. This study compared the chondrogenic quality of the MSCs derived from synovial fluid (MSCs-SF), bone marrow (MSCs-BM) and adipose tissue (MSCs-AT) of horses, through the evaluation of the aggrecan synthesis by differentiated chondrocytes. For this purpose, 10 horses were donors of synovial fluid (SF), bone marrow (BM) and adipose tissue (AT). The MSCs were extracted from these three sources, cultured and differentiated into chondrocytes from two methodologies. In the first method, pellets were cultured inside conical tubes, resulting in spheroids. The second method was made from the magnetization of the cells, with the formation of three-dimensional culture, originating microspheres. Chondrogenic differentiation was commercially induced (StemPro chondrogenesis differentiation kit - Thermo Fisher Scientific) in both methods. After the chondrogenic induction time, the spheroids and microspheres were incubated with guanidine hydrochloride (GuHCl) to extract proteoglycans. Aggrecan concentration in the spheroids and microspheres was quantified by ELISA with primary monoclonal anti-aggrecan antibody. The soluble proteins were quantified by the BCA method as a correction factor. Immunobloting was performed to identify aggrecan and keratan sulfate on spheroids. The identification of the aggrecan and keratan sulfate in the microspheres was demonstrated by high resolution confocal microscopy immunofluorescence. Cells in culture from different sources showed ability to adhere to plastic and a fibroblastic appearance, confirming the characteristic and morphology of MSCs. Both methodologies provided chondrogenic differentiation. Concentrations of the soluble proteins and aggrecan were higher in the spheroids derived from the MSCs-BM compared to the MSCs-AT (P <0.05) and the MSCs-SF showed no statistical difference between the two sources (P> 0.05) (Soluble proteins MSCs-SF 4.99±0.86; CTM-LS 4.14±1.03; CTM-AD 2.17±0.52) (Aggrecan CTM-BM 78.13±16.3; MSCs-SF 63.8±25.11; MSC-AT 26.63±9.85). However, the concentrations of the aggrecan did not present statistical difference between sources (P> 0.05) (Agrecam / soluble protein MSCs-BM 25.14 ± 11.62, MSCs-SF 11.3 ± 2.9, MSCs-AT 14.2±6.81). The wet weight of the spheroids was higher in the MSCs-BM than in the MSCs-AT (P <0.05) and the MSCs-SF showed no statistical difference between the two sources, however, the ratio between wet weight soluble protein and wet weight aggrecan showed no significant difference (P> 0.05) (Wet weight of the spheroids MSCs-BM 9.79±2.4; MSCs-SF 8.57±2.7; MSCs-AT 5.17±3.5; Soluble protein / wet weight ratio MSCs-BM 63.84±29.74; MSCs-SF 32.66±4.07; MSCs-AT 50.82±7.61; Aggrecan/ wet weight ratio MSCs-BM 1.01±0.47; MSCs-SF 0.32±0.07; MSCs-AT 0.78±0.43). Aggrecan and keratan sulfate were identified in the spheroids from the three sources, demonstrated by the Immunobloting technique. In the microspheres, soluble proteins concentrations were higher in those derived from MSCs-AT compared to MSCs-SF and MSCs-BM (P <0.05) (Soluble proteins MSCs-BM 27.7±2.57; MSCs-SF 22.02±1.84; MSCs-AT 35.22±2.82). However, the concentrations of aggrecan were higher in the microspheres derived from MSCs-SF in relation to the MSCs-BM and did not differ statistically from the MSCs-AT (Aggrecan MSCs-BM 63.06±12.07; MSCs-SF 141.21±25.49; MSCs-AT 117.14±14.32). Soluble protein and aggrecan ratio differed statistically, demonstrating superiority of MSCs-SF and MSCs-AT when compared to the MSCs-BM (Aggrecan/ soluble proteins ratio MSCs-BM 4.11±1.51; MSCs-SF 8.15±1.62; MSCs-AT 4.23±0.7). Microspheres from all sources expressed aggrecan and keratan sulfate by confocal immunofluorescence. It is concluded that the MSCs derived from the three sources produce aggrecan. The spheroids of MSCs-AT had lower productivity, but perform efficiency equal to those of MSCs-SF and MSCs-BM, that being confirmed by the aggrecan and soluble proteins ratio. The MSCs-SF and the MSCs-AT demonstrate chondrogenic superiority in three-dimensional environment. Finally, all three sources can be used in intra-articular treatments. In conjunction with biomaterials or scaffolds, the use of MSCs-SF or MSCs-AT should be recommended.