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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-213278

Resumo

O objetivo deste trabalho foi extrair, purificar, caracterizar e avaliar as atividades biológicas da lectina obtida de sementes de D. decaryi, além de analisar os compostos fitoquímicos presentes no extrato do tegumento das sementes, como também a atividade carrapaticida deste extrato. As sementes foram lavadas em água destilada e secas durante 5 dias. Foram preparados extratos a 10% com NaCl 0,15 M da casca, tegumento e endosperma da semente. Foram determinadas a atividade hemaglutinante (AH), dosagem proteica e atividade hemaglutinante específica (AHE) de todos os extratos. O extrato do tegumento apresentou maior AHE (196,03), sendo utilizado para precipitação com acetona 70% e purificação em Superdex G-75 em sistema AKTA, apresentando único pico no cromatograma, com massa molecular em condições nativas estimada em 34,8kDa. A lectina purificada de D. decaryi foi denominada DdeL. A lectina não foi específica para os tipos sanguíneos avaliados (A, B, AB, O e de coelho), porém maior AH foi observada quando na presença de sangue humano do tipo O e sangue de coelho. Esta lectina foi inibida apenas por glicoproteínas (albumina, azoalbumina e azocaseína), sua atividade foi estável na faixa de pH 5-10, no entanto, apresentou AH maior em pH ácido (pH 5-6), foi termoresistente, pois permaneceu ativa após 3h em temperatura a 100 °C. A atividade antibacteriana de DdeL (2,9 - 1500 µg/mL) foi realizada utilizando o método de microdiluição em caldo. Este ensaio demonstrou que DdeL exibiu atividade bacteriostática frente às bactérias patogênicas testadas, embora a concentração inibitória mínima (CIM) tenha sido elevada. As cepas mais sensíveis foram o isolado clínico Providencia stuartii e Staphylococcus aureus ATCC 29213, as quais apresentaram CIM de 750 µg/mL. A atividade bactericida não foi detectada para os isolados testados. A atividade antifúngica do extrato e DdeL foi realizada pelo teste de microdiluição em placas de 96 poços. Na atividade antifúngica foram avaliadas dez concentrações (2,6 1325 µg/mL) do extrato do tegumento das sementes de D. decaryi, como também, dez concentrações (0,03 16,5 µg/mL) de DdeL. O extrato do tegumento apresentou CMI50 de 5,18 µg/mL para os fungos da espécie Sporotrichum schenckii, e CMI100 ficou entre 10,35 - 82,81 µg/ml para estes fungos. Para os fungos da espécie Candida albicans, o extrato apresentou CMI50 entre 2,59 - 20,7 µg/mL, onde o mais resistente foi o C. albicans URM 6401 com CMI50 de 20,7 µg/mL. A CMI100 do extrato do tegumento para C. albicans foi de 662,5 - 1325 µg/mL. Em relação a DdeL, o S. schenckii URM 7971 foi o mais sensível na CMI50 de 0,26 µg/mL e os demais na CMI50 de 0,52 µg/mL. DdeL não apresentou CMI100 para as espécies de S. schenckii. Para C. albicans, DdeL apresentou CIM50 de 2,06 µg/mL e não foi capaz de inibir em 100% o crescimento destes fungos. A citotoxicidade para macrófagos (J774.A1) e células embrionárias renais (HEK-293) mostraram que a lectina não apresentou efeito citotóxico, além de ter estimulado a proliferação destas células. O extrato do tegumento de D. decaryi indicou a presença de diferentes grupos de metabólitos secundários e alguns constituintes, sugerindo biodisponibilidade de saponinas, taninos e flavonoides. Este extrato, avaliado em diferentes concentrações, apresentou capacidade do consumo de DPPH. O comportamento cinético da reação do DPPH com as diferentes concentrações do extrato, mostrou que as três concentrações maiores (1,73 mg/mL; 0,87 mg/mL; 0,35 mg/mL) atigiram o consumo máximo com dois minutos da reação, e o decaimento do DPPH foi estabilizando-se rapidamente. A maior concentração do extrato (1,73 mg/mL) sequestrou em torno de 100% do radical com dois minutos da reação. Na menor concentração, praticamente não houve sequestro de DPPH. No bioensaio carrapaticida frente a Dermacentor nitens, o controle positivo Cipermetrina 15%, foi ineficiente, pois, os carrapatos apresentaram resistência de 98,81% a este carrapaticida. O extrato bruto na concentração de 17,3 mg/mL também não foi eficiente e os carrapatos apresentaram 100% de resistência às concentrações mais elevadas do extrato. A concentração do extrato a 1,73 mg/mL apresentou 19,23% de eficiência, superior ao cipermetrina que apresentou 1,19% de eficiência. O precipitado proteico na concentração de 1,25 mg/mL obteve maior eficiência com 71,65%. O sobrenadante cetônico foi avaliado e apresentou 38,62% de eficiência. Os resultados mostraram a purificação e caracterização de uma nova lectina, termoresistente, com atividade bacteriostática a bactérias patogênicas, antifúngica a patógenos de humanos e que não apresentou efeitos citotóxicos, sendo uma proteína com potencial para aplicações biotecnológicas. Além disso, apresenta a composição fitoquímica do extrato do tegumento, a atividade sequestradora do radical DPPH e a atividade carrapaticida deste extrato, precipitado proteico e sobrenadante cetônico. Demonstrando o potencial biotecnológico do uso dessa espécie, ainda pouco estudada na comunidade científica, na medicina humana e animal.

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The objective of this study was to extract, purify, characterize and evaluate the biological activities of lectin obtained from D. decaryi seed, and analyzing the phytochemical compounds in the extract of the tegument as well as the acaricide activity of this extract. The seeds were washed in distilled water and dried for 5 days. Were prepared extracts 10% with 0.15 M NaCl of the bark, tegument and endosperm of the seed. The hemagglutinating activity (HA), protein dosage and specific hemagglutinating activity (AHE) of all extracts were determined. The extract of the tegument presented higher AHE (196,03), being used for precipitation with 70% acetone and purification in Superdex G-75 in AKTA system, presenting single peak in the chromatogram, with molecular mass in native conditions estimated at 34.8kDa. The purified lectin of D. decaryi was named DdeL. The lectin was not specific for the blood types evaluated (A, B, AB, O and rabbit), but higher AH was observed when in the presence of human type O blood and rabbit blood. This lectin was inhibited only by glycoproteins (albumin, azoalbumin and azocasein), its activity was stable in the range of pH 5-10, however, it presented higher AH in acid pH (pH 5-6), it was thermo-resistant, since it remained active after 3h at 100 ° C. The antibacterial activity of DdeL (2.9 - 1500 g/mL) was performed using the broth microdilution method. This assay demonstrated that DdeL exhibited bacteriostatic activity against the pathogenic bacteria tested, although the minimal inhibitory concentration (MIC) was elevated. The most sensitive strains were the clinical isolate Providencia stuartii and Staphylococcus aureus ATCC 29213, which presented MICs of 750 g/mL. The bactericidal activity was not detected for the tested isolates. The antifungal activity of the extract and DdeL was performed by the microdilution test in 96-well plates. In the antifungal activity, ten concentrations (2.6 -1325 g/mL) of the extract of the tegument of the seed of D. decaryi, as well as 10 concentrations (0.03 - 16.5 g/mL) of DdeL were evaluated. The extract of the tegument had a MIC50 of 5.18 g/mL for the fungi of the Sporotrichum schenckii species, and MIC100 was between 10.35 - 82.81 g/mL for these fungi. For the fungi of Candida albicans, the extract presented MIC50 between 2.59 - 20.7 g/mL, where the most resistant was C. albicans URM 6401 with MIC50 of 20.7 g/mL. The MIC100 of the extract of the tegument for C. albicans was 662.5 - 1325 g/mL. In relation to DdeL, S. schenckii URM 7971 was the most sensitive in MIC50 of 0.26 g/mL and the others in MIC50 of 0.52 g/mL. DdeL did not present MIC100 for S. schenckii species. For C. albicans, DdeL presented a MIC50 of 2.06 g/mL and was not able to inhibit the growth of these fungi in 100%. Cytotoxicity to macrophages (J774.A1) and renal embryonic cells (HEK-293) showed that the lectin did not present a cytotoxic effect and stimulated the proliferation of these cells. The extract of the tegument of the seeds of D. decaryi indicated the presence of different groups of secondary metabolites and some constituents, suggesting bioavailability of saponins, tannins and flavonoids. This extract, evaluated at different concentrations, showed DPPH consumption capacity. The kinetic behavior of DPPH reaction with different concentrations of the extract showed that the three highest concentrations (1.73 mg/mL, 0.87 mg/mL, 0.35 mg/mL) achieved the maximum consumption in two minutes from reaction, and DPPH decay rapidly stabilized. The highest concentration of the extract (1.73 mg/mL) sequestered around 100% of the radical with two minutes of the reaction. At the lowest concentration, there was practically no sequestration of DPPH. In the bioassay against ticks Dermacentor nitens, the positive control Cypermethrin 15%, was inefficient because the ticks were resistant to 98.81% this acaricide. The crude extract at the concentration of 17.3 mg/mL was also not efficient and the ticks showed 100% resistance at the highest concentrations of the extract. The extract concentration at 1.73 mg/mL presented 19.23% efficiency, higher than cypermethrin, which presented 1.19% efficiency. The protein precipitate at the concentration of 1.25 mg / mL obtained higher efficiency with 71.65%. The ketone supernatant was evaluated and presented 38.62% efficiency. The results showed the purification and characterization of a new lectin, thermoresistant, with bacteriostatic activity to pathogenic bacteria, antifungal to human pathogens and that did not present cytotoxic effects, being a protein with potential for biotechnological applications. In addition, it presents the phytochemical composition of the extract of the tegument of the seeds of D. decaryi, the sequestering activity of the DPPH radical and the acaricide activity of this extract, protein precipitate and ketone supernatant. Demonstrating the biotechnological potential of the use of this species, still little studied in the scientific community, in human and animal medicine.

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