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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-213296

Resumo

O campo de medicina regenerativa para animais de companhia vem crescendo nos últimos anos. As células-tronco mesenquimais (MSC) podem ser definidas como células-tronco adultas, multipotentes, com capacidade de se diferenciar em vários tipos celulares. A Sociedade Internacional de Terapia Celular (ISCT) estabeleceu critérios mínimos para definir MSC. As MSC podem ser isoladas de diferentes fontes como: polpa dentária e cordão umbilical. A polpa dentária contém uma população de células-tronco com localização perivascular e potencial de diferenciação em múltiplas linhagens semelhante à MSC obtidas a partir de outros tecidos. O fluconazol é um composto antifúngico usado isoladamente ou em combinação com outras drogas, por ter um amplo espectro. Ele exerce sua atividade antifúngica inibindo a síntese de ergosterol fúngico em um dos passos finais de sua biossíntese. Portanto, ele pode ser usado na coleta de dentes e na cultura de células-tronco de polpa dentária. Outra fonte de MSC utilizada é o cordão umbilical, onde sua coleta é menos invasiva, não gera riscos ao paciente e seu material normalmente seria descartado. O objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar e avaliar o potencial de proliferação e formação de colônias das células-tronco mesenquimais derivadas de polpa de dente canina (cDPSCs) e do tecido do cordão umbilical de cães (cUCSC). Foram coletadas três amostras de polpa dentária e três de cordão umbilical. As amostras foram dissociadas mecanicamente e isoladas por digestão enzimática usando colagenase tipo II. As células foram expandidas e foi realizada a diferenciação para as linhagens adipogênica, osteogênica e condrogênica. Para diferenciação osteogênica, o meio foi trocado três vezes por semana, em seguida as células foram coradas com Alizarina Red evidenciando os cristais de cálcio. Para diferenciação adipogênica, o meio foi trocado três vezes por semana e então as células foram coradas com Oil Red evidenciando os vacúolos lipídicos. Para a diferenciação condrogênica o meio foi trocado três vezes por semana e foram coradas com azul de toluidina evidenciando os mucopolissacarídeos. Para o ensaio clonogênico foram plaqueadas 300 células/poço em placas de seis poços e cultivadas durante nove dias, em seguida as colônias foram coradas com violeta cristal para serem contadas. Para o ensaio de proliferação, foram plaqueadas 1x104 células/poço em placa de seis poços, então a cada cinco dias foi realizada a dissociação enzimática e as células foram contadas em câmara de Neubauer. As cDPSC e cUCSC apresentaram aderência ao plástico e morfologia fibroblastoide após cultivo de acordo com os critérios mínimos da ISCT. Tanto as cDPSCs quanto as cUCT apresentaram potencial de diferenciação para as três linhagens (osteogênica, adipogênica e condrogênica). As cUCSC apresentaram maior taxa de proliferação (p=0.0414) e número de unidades formadora de colônia (p=0.0002) quando comparada as cDPSC na passagem três. Conclui-se que as cDPSC e cUCSC apresentaram as características de células-tronco mesenquimais e que as cUCSC até a passagem três possuem uma maior taxa de proliferação e maior quantidade de unidades formadoras de colônias que as cDPSC, podendo ser utilizadas na terapia celular.

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The field of regenerative medicine for pets has been growing in recent years. Mesenchymal stem cells (MSCs) can be defined as adult, multipotent stem cells with the ability to differentiate into several cell types. The International Society of Cell Therapy (ISCT) has set minimum criteria for defining MSCs. These MSCs can be isolated from different sources such as: dental pulp and umbilical cord. The dental pulp contains a population of stem cells (DPSC) with perivascular location and differentiation potential in multiple lineages similar to MSCs obtained from other tissues. Fluconazole is an antifungal compound used alone or in combination with other drugs because it has a large spectrum. It exerts its antifungal activity by inhibiting ergosterol fungal synthesis in one of the final steps of its biosynthesis. Therefore, it can be used in teeth collection and stem cell culture of dental pulp. Another source of MSCs used is umbilical cord. The collection is less invasive, painful and with lower mortality when compared to collection of the bone marrow. The aim were isolate, characterize and evaluate the potential of proliferation and colonies formation of mesenchymal stem cells derived from dental pulp (cDPSC) and umbilical cord tissue of dogs (cUCSC). Three samples of dental pulp and umbilical cord were collected. The samples were mechanically dissociated and isolated by enzymatic digestion using type II collagenase and cultivate with IMDM and fetal bovine serum. The differentiation was made for adipogenic, osteogenic and chondrogenic lineages. For osteogenic differentiation, the medium was changed three times per week for seven days, then the cells were stained with Alizarin Red evidencing calcium crystals. For adipogenic differentiation, the medium was changed three times per week for 21 days, then the cells were stained with Oil Red evidencing lipid vacuoles. For chondrogenic differentiation the medium was changed three times at week for 21 days, then stained with toluidine blue evidencing mucopolysaccharides. For clonogenic assay, 300 cells/well were plated in 6-well plates and cultured for nine days, then colonies were stained with crystal violet and counted. For proliferation assay, 10,000 cells/well were plated in six-well plate, enzymatic dissociation was performed every five days and cells were counted in a hemocytometer. The cDPSC and cUCSC showed adherence to the plastic and fibroblastroid morphology after culture according to guidelines of the ISCT. In addition, they also shown differentiation potential for the three lineages: osteogenic, adipogenic and chondrogenic. The cUCSC presented higher number of colony forming units when compared to cDPSC at third passage. Regarding proliferation, cUCT presented a higher rate when compared to cDPSCs at third passage. In conclusion, cDPSC and cUCSC showed characteristics of mesenchymal stem cells and cUCSC at third passage had a higher rate of proliferation and more of colony-forming units in comparison to cDPSC, can be used in cell therapy.

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