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AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIVIRAL DE DUAS FRAÇÕES DE SAPONINAS DE QUILLAJA SPP. FRENTE À ARBOVÍRUS E FORMULAÇÃO DE MATRIZES ISCOM

EDUARDO ARTUR TROIAN.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-213348

Resumo

Saponinas são moléculas anfifílicas que apresentam versatilidade no que diz respeito a suas propriedades biológicas. Uma das propriedades biológicas mais estudadas remete à atividade imunoadjuvante, sendo a fração comercial Quil-A®, obtida a partir das cascas de Quillaja saponaria amplamente pesquisada frente ao sistema imune. O principal limitante quanto ao seu uso em humanos é a toxicidade. Uma alternativa para atenuar a citotoxicidade é a complexação com colesterol, fosfatidilcolina e um antígeno, originando complexos imunoestimulantes (ISCOMs). Também é descrita a atividade antiviral para saponinas frente a vírus envelopados e não envelopados de DNA e RNA. Uma questão pertinente ao estudo das saponinas de Q. saponaria remete à depredação da espécie, uma vez que as cascas constituem a principal fonte de obtenção. Neste contexto, a espécie congênere Q. brasiliensis vem sendo estudada como uma alternativa, uma vez que as folhas são ricas em saponinas. O presente trabalho propôs-se a avaliar o potencial antiviral de uma fração purificada de saponinas de Q. brasiliensis denominada Fração B e de uma fração comercial de Q. saponaria denominada Quil-A® frente ao vírus da Febre Amarela (YFV) e ao vírus Chikungunya (CHIKV), bem como realizar um estudo de formulação de matrizes ISCOM. Para tanto, foi avaliada a citotoxicidade da Fração B e de Quil-A® em células VERO (por serem permissivas à replicação viral) por meio do ensaio de MTT. A avaliação da atividade antiviral foi realizada pelos ensaios de inibição do efeito citopático e por redução no número de placas de lise. A formação de matrizes ISCOM foi realizada através da técnica de injeção de etanol, sendo caracterizadas posteriormente por microscopia eletrônica de transmissão (MET), espalhamento de luz dinâmico e potencial zeta. A Fração B se mostrou ligeiramente menos citotóxica que Quil-A® em todos os tempos de exposição testados. As saponinas demonstraram ausência de atividade frente ao YFV, a qual foi confirmada através do ensaio de inibição do efeito citopático. Por outro lado, as saponinas foram eficazes ao bloquear a replicação viral do CHIKV, atingindo percentuais de inibição de 95% para Quil-A® e 97% para Fração B. Quanto às matrizes ISCOMs, foram elaboradas sete formulações, sendo uma utilizando Quil-A® (controle positivo) e as demais Fração B. A proporção descrita na literatura como otimizada à formulação dos complexos para Quil-A®, 63:12:24, também resultou em mais estruturas típicas para Fração B. Mesmo não apresentando ação frente ao YFV, as saponinas mostraram-se promissores agentes antivirais. Desta forma, a avaliação dos mecanismos pode auxiliar no entendimento de como estas atuam no bloqueio da replicação viral. No que diz respeito às matrizes ISCOM, com base na proporção otimizada para formulação pode-se realizar a avaliação das propriedades biológicas das estruturas com ou sem antígenos.
Saponins are amphiphilic molecules that exhibit versatility regarding their biological properties. One of the most studied biological properties refers to immunoadjuvant activity. Quil-A® fraction is a commercially available fraction obtained from the barks of Quillaja saponaria and it is extensively researched about its immunostimulatory activity. The main limiting factor for its use in humans is toxicity. An alternative to attenuate cytotoxicity is the complexation with cholesterol, phosphatidylcholine and an antigen, forming immunostimulating complexes (ISCOMs). Another biological property refers to the antiviral activity, and it is known that they act against enveloped and nonenveloped DNA and RNA viruses. A concern involving the study of the saponins from Q. saponaria refers to the depredation of the specie, since the barks are the main source of saponins. In this context, the congener specie Quillaja brasiliensis has been studied as an alternative once the leaves are rich in saponins. The present work aimed to evaluate the antiviral potential of a purified fraction of saponins from Q. brasiliensis named Fraction B against Yellow Fever Virus (YFV) and Chikungunya Virus (CHIKV), as well as to perform a formulation study of ISCOM matrices. The cytotoxicity of Fraction B and Quil-A® was evaluated in VERO cells (permissive to viral replication) using the MTT assay. The antiviral screening was performed by the cytopathic effect inhibition assay and by plaques reduction assay. ISCOM matrices were formulated by ethanol injection technique. Structures were characterized by transmission electron microscopy (TEM), dynamic light scattering and zeta potential. Fraction B was slightly less cytotoxic than Quil-A® in all exposure times tested. Saponins demonstrated absence of activity against YFV, which was confirmed by the cytopathic effect inhibition assay. On the other hand, they were effective blocking CHIKV replication, reaching 95% inhibition percentages for Quil-A® and 97% for Fraction B. As for the ISCOMs matrices, seven formulations were prepared, one using Quil- A® (positive control) and the remaining using Fraction B. The optimized proportion related for Quil-A® 63:12:24 also resulted in the highest number of typical ISCOM structures for Fraction B. Though they did not inhibit viral replication for YFV, saponins were promising antiviral agents for CHIKV. The evaluation of the antiviral mechanisms may help understanding how they act in blocking viral replication. Regarding the ISCOM matrices, the biological properties of the structures with or without an antigen can be determined based on the optimized formulation ratios.
Biblioteca responsável: BR68.1