UTILIZAÇÃO DA ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO PRÓXIMO (NIR) COMO FERRAMENTA PARA DIFERENCIAR PERFIS ESPECTRAIS ASSOCIADOS AO CULTIVO IN VITRO DE OÓCITOS DE CABRAS

RESUMO

A tecnologia de espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) é uma técnica analítica automatizada que permite a investigação de perfis espectrais (ou chamado fingerprint metabólico) baseados nos metabólitos presentes na amostra analisada, de forma rápida, não invasiva e com mínima preparação prévia. A técnica em associação com métodos estatísticos multivariados vem sendo aplicada na análise de meios de cultivo in vitro (CIV) de oócitos e embriões, a fim detectar diferenças metabólicas entre perfis espectrais. Dessa forma, o presente estudo tem como objetivo discriminar os perfis espectrais do meio de cultivo após a maturação in vitro (MIV) oocitária e CIV de prováveis embriões de cabras de diferentes idades submetidas a repetidos tratamentos hormonais. Para tanto, 19 cabras (jovens = 10; velhas = 9) de peso e escore corporal homogêneo foram submetidas à três sessões de estimulação hormonal (HS) com gonadotrofinas e os complexos cumulus oophorus (COCs) foram obtidos por aspiração folicular guiada por laparoscopia (LOPU). Os COCs recuperados e classificados (Grau I-III) foram submetidos a MIV e ativação partenogenética. Os presumíveis zigotos foram submetidos ao CIV por dois dias (D2). O meio de cultivo foi coletado após a MIV dos oócitos e no D2 de CIV de cada grupo experimental (Jovens vs Velhos; Sessões de HS) e analisado por espectroscopia NIR. Os dados espectrais NIR foram interpretados através de métodos quimiométricos, tais como análise de componentes principais (PCA) e análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA). Os resultados da análise de PCA mostraram claramente uma separação entre os perfis espectrais dos grupos experimentais (animais jovens e velhos; sessões de HS), tanto após a MIV como o CIV. No geral, as principais bandas de absorção foram atribuídas ao segundo sobretom do grupo C-H, primeiro sobretom das ligações de O-H e N-H e combinações de C-H, podendo servir como marcadores moleculares. Por outro lado, a análise dos dados espectrais pelo modelo de PLS-DA forneceu uma melhor classificação dos grupos. Os resultados mostraram uma separação dos grupos de animais jovens e velhos, bem como das três sessões de HS com alta especificidade, sensibilidade e acurácia utilizando espectros NIR. Assim, a análise do meio de cultivo utilizando a espectroscopia NIR combinada com métodos multivariados indicou diferenças entre os grupos experimentais e forneceu informações úteis sobre o desenvolvimento in vitro de oócitos e embriões caprinos.

ABSTRACT

Near infrared spectroscopy (NIR) technology is an automated analytical technique that allows the investigation of spectral profiles (or so-called metabolic fingerprint) based on the metabolites present in the analyzed sample, in a fast, non-invasive manner and with minimal prior preparation. The technique in association with multivariate statistical methods has been applied in the analysis of in vitro culture (IVC) media of oocytes and embryos in order to detect metabolic differences between spectral profiles. Therefore, the present study aimed to discriminate the spectral profiles of the culture medium after the in vitro maturation (IVM) of oocytes and IVC of embryos of goats with different ages submitted to repeated hormonal treatments. Thus, 19 goats (young = 10; old = 9) of homogeneous body weight and condition score were submitted to three sessions of hormonal stimulation (HS) with gonadotrophins and cumulus oophorus complexes (COCs) were obtained by laparoscopic ovum pick-up (LOPU). The recovered and classified COCs (Grade I-III) were submitted to IVM and parthenogenetic activation. The presumptive zygotes were submitted to IVC for two days (D2). The culture medium was collected after the IVM of the oocytes and on the D2 of IVC of each experimental group (young vs. old; HS Sessions) and analyzed by NIR spectroscopy. NIR spectral data were interpreted using chemometric methods such as principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA). The results of the PCA analysis clearly showed a separation between the spectral profiles of the experimental groups (young and old animals; HS sessions), both after IVM and IVC. In general, the main absorption bands were assigned to the second overtone C-H, the first O-H and N-H overtone and C-H combinations, which could serve as molecular markers. On the other hand, the analysis of the spectral data by the PLS-DA model provided a better classification of the groups. The results showed a separation of the groups of young and old animals, as well as the three HS sessions with high specificity, sensitivity and accuracy using NIR spectra. Thus, analysis of the culture medium using NIR spectroscopy combined with multivariate methods indicated differences between the experimental groups and provided useful information on the in vitro development of goat oocytes and embryos.