DIVERSIDADE GENÉTICA E CARACTERIZAÇÃO DA VIRULÊNCIA EM Staphylococcus aureus ISOLADOS DE MASTITE EM REBANHOS BOVINOS BRASILEIROS

RESUMO

A mastite bovina é a doença de maior impacto econômico para a bovinocultura leiteira em todos os continentes e Staphylococcus aureus é um de seus principais agentes etiológicos. Este patógeno possui uma variedade de fatores de virulência que levam a mastite clínica ou subclínica e infecções intramamárias crônicas de difícil tratamento. Além da mastite, este agente é responsável por outras enfermidades nos animais e no homem, tais como, endocardites, osteomielites e septicemia, sendo bastante importante para a saúde pública. Os objetivos desse trabalho foram realizar a caracterização fenotípica, usando como modelo experimental larvas de Galleria mellonella, e genotípica, pelas técnicas de Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE), Multiple locus VNTR fingerprinting (MLVF) e prospecção de genes de virulência codificadores de adesinas e toxinas em duas populações de S. aureus provenientes de mastite bovina, isolados entre os anos de 1994 e 2014, sendo uma restrita ao Estado de Minas Gerais, contendo isolados de origem clínica e subclínica, e outra contendo isolados de mastite subclínica de rebanhos de sete estados brasileiros. Os resultados das análises fenotípicas mostraram que larvas de G. mellonella constituem um modelo prático e eficiente para avaliar fenótipos de virulência em isolados de S. aureus provenientes de mastite bovina, permitindo a distinção de isolados mais e menos virulentos. A infecção experimental em G. mellonella demonstrou que os isolados provenientes de mastite subclínica foram, em geral, mais virulentos. As técnicas de genotipagem utilizadas se mostraram efetivas para caracterização de S. aureus e apontaram a existência de tipos genéticos predominantes amplamente disseminados entre diferentes rebanhos. Embora a PFGE tenha sido ligeiramente mais discriminatória, a MLVF também se confirmou como uma boa técnica de tipagem, permitindo um agrupamento que refletia parcialmente o agrupamento demonstrado pela PFGE. A MLVF, com um nível de similaridade de 80%, apresentou um cluster com predomínio de amostras clínicas e outro com amostras subclínicas em predominância. O conjunto de genes de virulência que codificam os fatores de aglutinação (ClfA e ClfB), a proteína de ligação à fibronectina (FnBPA), as toxinas (Hla, Hlb e Luk-ED), a proteína de ligação a elastina (Ebps) e a proteína de ligação ao colágeno (Cna) foi amplamente presente na população de isolados de mastite subclínica provenientes de sete estados brasileiros sendo que a frequência desses genes variou de 58 a 97,7%. Os resultados demonstraram que esse conjunto de proteínas deve ser melhor avaliado e pode ser promissor como um conjunto de antígenos para constituir novas vacinas para prevenção da mastite causada por S. aureus em rebanhos bovinos brasileiros. Em conclusão, este trabalho contribuiu para o entendimento da epidemiologia da mastite bovina no Brasil, demonstrando a grande diversidade genética dos isolados que causam mastite no país, porém, com predomínio de linhagens especializadas que devem ser mais bem estudadas para o desenvolvimento de novas formas de controle e prevenção desta doença.

ABSTRACT

The bovine mastitis is the disease of greatest economic impact for dairy herds worldwide and Staphylococcus aureus is one of its main etiological agents. This pathogen has a variety of virulence factors that lead to clinical or subclinical mastitis, and chronic intramammary infections of difficult treatment. In addition to mastitis, this agent is responsible for other diseases in animals and man, such as endocarditis, osteomyelitis and septicemia, being quite important for public health. The objectives of this work were to accomplish the phenotypic characterization, using the experimental model of Galleria mellonella larvae and genotypic using the Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE), Multiple Locus VNTR fingerprinting (MLVF) and prospect of virulence genes encoding adhesins and toxins in two populations of S. aureus from bovine mastitis, isolated between 1994 and 2014, being one restricted to the State of Minas Gerais, containing isolates of clinical and subclinical origin and one containing subclinical mastitis isolates from herds of seven Brazilian states. The results of the phenotypic analyzes showed that G. mellonella larvae constitute a practical and efficient model to evaluate virulence phenotypes in S. aureus isolates from bovine mastitis, allowing the distinction of more and less virulent isolates. The experimental infection in G. mellonella showed the predominance of more virulent strains among those coming from subclinical mastitis. The genotyping techniques used were effective for the characterization of S. aureus and indicated the existence of predominant genetic types widely disseminated among different herds. Although PFGE was slightly more discriminatory, MLVF also was confirmed as a good typing technique, allowing a clustering that partially reflected the clustering demonstrated by PFGE. The MLVF, with a level of similarity of 80%, showed a cluster with predominance of clinical strains and another with predominance of subclinical strains. The set of virulence genes encoding agglutination factors (ClfA and ClfB), fibronectin binding protein (FnBPA), toxins (Hla, Hlb and Luk-ED), elastin binding protein (Ebps), and the collagen binding protein (Cna) was widely present in the population of subclinical mastitis isolates from seven Brazilian states and the frequency of these genes ranged from 58 to 97.7%. The results show that this set of proteins should be better evaluated and may be promising as a set of antigens to constitute news vaccines for prevention of mastitis caused by S. aureus in Brazilian dairy herds. In conclusion, this work contributed to the understanding of the epidemiology of bovine mastitis in Brazil, showing the great genetic diversity of the isolates that cause mastitis in the country, but with a predominance of specialized strains that should be better studied for the development of new forms of control and prevention of this disease.