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EFEITO DA PROTEÍNA MORFOGENÉTICA ÓSSEA 15 (BMP15) NO CULTIVO IN SITU DE TECIDO OVARIANO DE CATETOS (Pecari tajacu LINNAEUS, 1958)

HENRIQUE ALBANO NOGUEIRA GOMES.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-213624

Resumo

Os catetos são animais silvestres que possuem grande importância ecológica e potencial econômico. Assim, a fim de aumentar o potencial reprodutivo desta espécie, biotécnicas como cultivo in vitro de folículos pré-antrais vem sendo estudadas. Sabe-se que a foliculogênese pré-antral é regulada por fatores autócrinos e parácrinos em um mecanismo orquestrado que define o curso de desenvolvimento ou morte folicular. Entre esses fatores está a proteína morfogenética óssea 15 (BMP15), que atua na ativação, sobrevivência e desenvolvimento folicular em diferentes espécies. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de BMP15 sobre a sobrevivência, ativação, crescimento e proliferação das células da granulosa de folículos pré-antrais de catetos cultivados in vitro por 6 dias. Para tanto, 5 pares de ovários foram coletados de fêmeas de cateto e de cada par foram retirados fragmentos do córtex, dos quais, um foi utilizado como controle fresco, e os demais foram cultivados in vitro por 1 ou 6 dias nos diferentes tratamentos: 0, 1, 25 e 50 ng/mL de BMP15. Os fragmentos do controle fresco e pós-cultivo foram fixados, processados para histologia clássica (hematoxilina/eosina e AgNOR) para a confecção das lâminas. Os folículos ovarianos foram avaliados quanto à morfologia, sendo classificados em normais ou degenerados e quanto ao grau de evolução, sendo classificados em primordiais ou em desenvolvimento (primários e secundários). Este último parâmetro foi utilizado para o estudo da ativação folicular, levando em consideração a razão entre o percentual de folículos primordiais e em desenvolvimento ao longo do cultivo. Além disso, os folículos e oócitos foram mensurados antes e após o cultivo para registrar o crescimento folicular e oocitário. A proliferação celular dos folículos ovarianos durante o cultivo foi avaliada pela contagem das regiões organizadoras nucleolares (NORs) pela técnica de AgNOR. O controle fresco apresentou altas taxas de folículos com morfologia normal (92.68% ± 1,09) e, após o cultivo, a adição de BMP15 (25 ng/mL) ao meio resultou numa maior percentagem de folículos normais (79,67% ± 0,69) quando comparada aos demais tratamentos (P<0,05), exceto 1 ng/mL BMP15 (74,00% ± 1,90) (P> 0,05). Além disso, as concentrações mais elevadas de BMP15 (25 ng/ml e 50 ng/ml) estimularam a ativação dos foliculos primordiais em relação ao controle cultivado (P<0,05). No entanto, esta substância não demonstrou efeitos no crescimento oocitário e folicular. Todas as concentrações de BMP15 utilizadas aumentaram o número de NORs após 1 dia de cultivo em relação ao controle fresco e cultivado (P<0,05), e após 6 dias de cultivo, o número de NORs nos fragmentos cultivados em todos os tratamentos foi maior do que a observada no controle fresco (P<0,05). Em conclusão, a adição de 25 ng/ml de BMP15 ao meio de cultivo de folículos pré-antrais de catetos mantém um elevado número de folículos morfologicamente saudáveis e estimula a ativação de folículos primordiais após 6 dias de cultivo.
Collared peccaries are wild animals that have a great ecological importance and economic potential. Thus, in order to increase reproductive potential this species, biotechniques such as in vitro culture of preantral follicles have been studied. It is known preantral folliculogenesis is regulated by autocrine and paracrine factors in an orchestrated mechanism that defines the course of development or death. Among these factors is bone morphogenetic protein 15 (BMP15), which acts on activation, survival and follicular development in different species. Nevertheless, the roles of BMP15 in the regulation of primordial follicle development in collared peccaries remains unknown. The aims of present study were to investigate the effects of BMP15 on in vitro culture of collared peccaries preantral follicles using histological studies. To this end, fragments of collared peccaries (Pecari tajacu) ovarian cortex were cultured for 1 or 6 days, at 38.5 °C in an atmosphere containing 5% CO2, in TCM199+ (control medium) supplemented with different concentrations of recombinant human BMP15 (rhBMP15, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) (1, 25 and 50 ng/mL). The fresh control and cultured fragments were fixed, processed for classical histology (hematoxylin/eosin and AgNOR), and the ovarian follicles were evaluated for morphology, classified as normal or degenerate, and classified as primordial or developing (primary and secondary). The latter parameter was used for study of follicular activation, taking into account the ratio between percentage of primordial and developing follicles throughout the culture. In addition, follicles and oocytes were measured before and after culture to record follicular and oocyte growth. The cell proliferation of ovarian follicles during experiment was evaluated by counting the nucleolar organizing regions (NORs) by the AgNOR technique. The fresh control showed high rates of follicles with normal morphology (92.68% ± 1.09) and, after culturing, addition of BMP15 (25 ng/mL) to medium resulted in a higher percentage of normal follicles (79.67 ± 0.69) compared to the other treatments (P<0.05), except for 1 ng/mL BMP15 (74.00% ± 1.90) (P>0.05). In addition, higher concentrations of BMP15 (25 ng/ml and 50 ng/ml) stimulated the activation of primordial follicles in relation to cultured control (P<0.05). However, this substance did not demonstrate effects on oocyte and follicular growth. All concentrations of BMP15 used increased the number of NORs after 1 day of cultivation relative to fresh and cultivated control (P<0.05), and, after 6 days, number of NORs in fragments cultured in all treatments was higher than that observed in fresh control (P <0.05). In conclusion, the addition of 25 ng/ml of BMP15 to culture medium of preantral follicles of peccaries maintains a high number of morphologically healthy follicles and stimulates activation of primordial follicles after 6 days of culture.
Biblioteca responsável: BR68.1