Prospecção e toxicidade de óleos essenciais de plantas da família Lamiaceae em Pseudomonas spp. isoladas de cães e perfil de resistência da bactéria

RESUMO

As afecções dermatológicas apresentam grande importância em pequenos animais, destacando-se as infecções pelo gênero Pseudomonas, que se apresenta resistente a maioria dos antimicrobianos utilizados na clínica médica. A resistência bacteriana é fonte de preocupação, aumentando as pesquisas em busca de novas opções terapêuticas, como as plantas medicinais, podendo-se citar a Família Lamiaceae. Assim, o objetivo do trabalho foi verificar a casuística de Pseudomonas aeruginosa em amostras de otites de cães recebidas pelo Laboratório Regional de Diagnóstico (LRD),determinar o perfil de resistência de Pseudomonas spp.a antimicrobianos e aos óleos essenciais de Origanum vulgare, Origanum majorana e Rosmarinus officinalis, avaliar um possível sinergismo dos óleos com antimicrobianos, assim como determinar a composição química dos óleos e a citotoxicidade destes em células MDBK e em espermatozóides, através dos métodos CASA e citometria de fluxo. Para o levantamento da casuística de otites registradas no LRD, avaliou-se todas as fichas de 2010 a 2018 de cães, sendo selecionadas aquelas com isolamento deP. aeruginosa. Os óleos essenciais utilizados no estudo, foram obtidos através de hidrodestilação por arraste à vapor, sendo testados nas concentrações de250g/mL-1.Para o antibiograma (Kirby-Bauer,1966) utilizou-se 13 fármacos, sendo que para avaliação da susceptibilidade de Pseudomonas spp. aos óleos essenciais e para a associação dos antimicrobianos com os óleos, o método de difusão em disco foi usado.Para avaliação da citotoxicidade, utilizou-se células renais (MDBK) e células espermáticas, sendo a toxicidade de MBDK avaliada pelo método MTT e dos espermatozóides por CASA e citometria de fluxo.P. aeruginosa esteve presente em 11% das amostras de otite canina recebidas entre 2010 e 2018 no LRD. Os isolados caninos de Pseudomonas spp. apresentaram alta taxa de multiresistência (46,7%)aos antimicrobianos, em especial aos B-lactâmicos, sendo sensíveis para Quinolonas, Gentamicina e Imipenem. Os óleos essenciais inibiram Pseudomonas spp., formando halos de inibição maiores para OERO seguido de OEOM e OEOV. Quando se avalio uos óleos essenciais com os antimicrobianos, observou-se sinergismo em 90% das associações. OEOV e OEOM apresentaram composição majoritária de Gamma-Terpinene, 4-Terpineol e Alpha-Terpinene, enquanto em OERO destacaram-se Cineole, Alpha-Pinene e Camphor. Todos os óleos apresentaram citotoxicidade alta à partir de 0,24 g/mL-1 para MDBK, sendo OERO o mais citotóxico.No CASA, observou-se aumento na motilidade das células espermáticas nas concentrações de 20g/mL-1 e 40g/mL-1 em 0 e 24hs de exposição ao OEOV sendo que ocorreu redução destas à partir de 160g/mL-1. OEOM na concentração de 20g/mL-1 não alterou MT e MP, Distância média percorrida, Amplitude do deslocamento lateral da cabeça e Frequência do batimento flagelar cruzado, independente do tempo de exposição. Houve aumento da fluidez total nas concentrações de 20 a 40g/mL-1 e fluidez viável em 40 e 80g/mL-1 para OEOV e OEOM.Na citometria de fluxo, os parâmetros avaliados não sofreram alterações significativas na concentração de 20 a 40g/mL-1 de OEOV nas 24hs de exposição, havendo para OEOM, alterações significativas à partir da concentração de 40g/mL-1, em 0 e 24 horas.As alterações provocadas pelas concentrações maiores dos óleos sugerem toxicidade, assim como evidenciam os possíveis mecanismos de ação a serem explorados para aplicação farmacológica dos óleos da família Lamiaceae, em especial Origanum vulgare.

ABSTRACT

Dermatological conditions are of great importance in small animals, especially Pseudomonas infections, which are resistant to most antimicrobials used in medical practice. Bacterial resistance is a source of concern, increasing research in search of new therapeutic options, such as medicinal plants, including the Family Lamiaceae. The objective of this study was to verify the Pseudomonas aeruginosa casuistry in samples of dog otitis received by the Regional Diagnostic Laboratory (LRD), to determine the resistance profile of Pseudomonas spp. To antimicrobials and to the essential oils of Origanum vulgare, Origanum majorana and Rosmarinus officinalis, to evaluate a possible synergism of the oils with antimicrobial agents, as well as to determine the chemical composition of the oils and the cytotoxicity of these oils in MDBK cells and in spermatozoa through the CASA and flow cytometry methods. For the study of the sample of otites registered in the LRD, all the records from 2010 to 2018 of dogs were evaluated, and those with P. aeruginosa isolation were selected. The essential oils used in the study were obtained by steam distillation and were tested at concentrations of 250g / mL-1. For the antibiogram (Kirby-Bauer, 1966) 13 drugs were used, and for the evaluation of the susceptibility of Pseudomonas spp. essential oils and the association of antimicrobials with oils, the disc diffusion method was used. To evaluate cytotoxicity,renal cells (MDBK) and sperm cells were used, and the toxicity of MBDK was evaluated by MTT and spermatozoa by CASA and flow cytometry. P. aeruginosa was present in 11% of the canine otitis samples received between 2010 and 2018 in the LRD. Canine isolates of Pseudomonas spp. presented a high rate of multiresistance (46.7%) to antimicrobials, especially B-lactams, being sensitive for Quinolones, Gentamycin and Imipenem. The essential oils inhibited Pseudomonas spp., Forming larger inhibition halos for OERO followed by OEOM and OEOV. When evaluating the essential oils with antimicrobials, synergism was observed in 90% of the associations. OEOV and OEOM presented the majority composition of Gamma-Terpinene, 4-Terpineol and Alpha-Terpinene, while in OERO they stood out Cineole, Alpha-Pinene and Camphor. All oils showed high cytotoxicity from 0.24 g / mL-1 to MDBK, OERO being the most cytotoxic. At CASA, increased sperm cell motility at concentrations of 20g / mL-1 and 40g / mL-1 at 0 and 24 hours of OEOV exposure was observed, with a reduction of 160g / mL-1. OEOM at the concentration of 20 g / mL-1 did not alter MT and MP, mean distance traveled, amplitude of the lateral displacement of the head and frequency of the crossed flagellar beat, regardless of the time of exposure. There was an increase in total fluidity at concentrations of 20 to 40 g / mL-1 and viability at 40 and 80 g / mL for OEOV and OEOM. In the flow cytometry,the parameters evaluated did not undergo significant changes in the OEOV concentration of 20 to 40 g / mL-1 in the 24 hours of exposure, with OEOM, significant changes from the concentration of 40 g / mL, in 0 and 24 hours. The changes caused by the higher concentrations of the oils suggest toxicity, as well as evidence the possible mechanisms of action to be explored for the pharmacological application of the oils of the family Lamiaceae, especially Origanum vulgare.