Caracterização de Malassezia spp isoladas de conduto auditivo de cães e gatos e avaliação dos fatores virulência

RESUMO

O gênero Malassezia compreende 17 espécies de leveduras lipofílicas e lipodependentes, componentes naturais da microbiota da pele dos animais homeotérmicos, incluindo humanos, e conhecido agente oportunista em dermatites e otites. A maior parte da casuística de otite fúngica em cães é atribuída a M. pachydermatis, mas espécies lipodependentes também podem ser agentes desta afecção, sendo possível que haja subdiagnósticos. Na rotina clínica veterinária, é comum o uso do exame direto de amostras otológicas como ferramenta auxiliar para direcionar uma melhor conduta terapêutica. Tendo esses pontos em vista, o trabalho objetiva realizar isolamento de Malassezia spp. a partir de amostras de otite de cães e gatos, identificando-as à nível de espécie, observar a presença da Malassezia em infeções mistas ou puras, verificar in vitro a produção dos principais fatores de virulência inerentes à patogenicidade e correlacionar a produção dos fatores de virulência com a natureza da infecção. Foram utilizadas 170 amostras oriundas dos condutos auditivos externos de 94 cães e 11 gatos com otite clínica, encaminhadas ao Laboratório de Leveduras Patogênicas e Ambientais, onde foram semeadas nos meios Agar Dixon Modificado e Agar Sabouraud Dextrose 2% com Cloranfenicol. Foram realizados testes clássicos para identificação fenotípica, como preconizado por Kurtzman et al. (2011) e análise proteômica por Maldi-TOF e bioquímico por VITEK2 ® para confirmação da identificação. Para análise da virulência foram testadas as produções de proteases, fosfolipase, lipases, esterases e hemolisina. Dos 105 animais, 63% (66) animais possuiam Malassezia sp. nas suas amostras, sendo uma lipodependente, e 37% (39) não tinham a levedura. O valor preditivo positivo e negativo do exame direto foram 75,58 e 67,19%, respectivamente. A sensibilidade do exame em relação ao isolamento foi de 75,58% e a especificidade de 67,19%. Não houve diferença estatística entre a recuperação das leveduras no diagnóstico em Agar Sabouraud Dextrose 2% e Agar Dixon Modificado. A identificação por espetrofotometria de massa teve 82% de acurácia na identificação dos isolados e as restantes não tiveram scores de identificação, enquanto o VITEK ® , identificou erroneamente todas as amostras. Para os testes enzimáticos, 100% (96) das amostras foram positivas para a produção de proteases e lipases. Apenas uma amostra não foi produtora de fosfolipase e esterase. 89% (86) amostras foram positivas para a produção de hemolisina. Conclui-se que a utilização do Agar Dixon Modificado é importante na rotina laboratorial de diagnóstico microbiologico de otites canina e felina, para ampliar a gama de espécies de Malassezia diagnosticadas. O exame direto mostrou ser um bom indicador para a presença da levedura, mas não necessáriamente para indicar seu envolvimento na infecção. Para além, percebe-se que essas leveduras in vitro possuem alta atividade enzimática, podendo fazer parte da patogênese da otite microbiana, mesmo quando não é o principal agente envolvido, como nas otites mistas, mesmo as que possuem contagens baixas no isolamento.

ABSTRACT

The genus Malassezia currently comprises 17 species of lipophilic and lipid- dependent yeasts. Considered a normal part of the skin microbiota of warm-blooded vertebrates, including humans, these may also become opportunistic agents in dermatitis and otitis. Fungal otitis in dogs have been associated with M. pachydermatis, but lipid- dependent species are also commonly found, indicating a possibility of frequent misdiagnosis. In the veterinary clinical routine, microscopy of otological samples is used as an auxiliary tool towards the implementation of an adequate drug therapy. The aim of this work was the isolation of Malassezia spp. from otitis samples from dogs and cats, their respective identification at the species level, observe the presence of Malassezia in pure or co-infections, in vitro detection the main virulence factors inherent to the genus pathogenicity being produced, and the establishment of a correlation between the detected virulence factors being produced and the nature of the infection. A total of 170 samples from the external ear canal of 94 dogs and 11 cats with clinical otitis were sent to the Laboratory of Pathogenic and Environmental Yeasts, where they were inoculated in Modified Dixon Agar and Sabouraud Dextrose 2% Agar supplemented with chloramphenicol. Classical methods allowed for the phenotypic identification, as recommended by Kurtzman et al. (2011) further corroborated through proteomic analysis by MALDI-TOF MS and biochemical analysis by VITEK2 ® . For virulence analysis, protease, phospholipase, lipase, esterase and hemolysin production were tested. Of the 105 animals, 63% (66) individuals were positive for Malassezia sp., as one lipid dependent, and 37% (39) were negative for the genus. The positive and negative predictive values of the direct exam were 75.58% and 67.19%, respectively. The sensitivity of the isolation test was 75.58% and the specificity 67.19%. There was no significant difference between yeast recovery in Sabouraud Dextrose 2% Agar and Modified Dixon Agar. The identification by mass spectrophotometry had an 82% accuracy in the identification of the isolates and remaining isolates did not reach the identification score, whereas VITEK® misidentify all the samples. For the enzymatic tests, 100% (96) of the samples were positive for the production of proteases and lipases. Only one sample did not produce phospholipase nor esterase. 89% (86) samples were hemolysin producers. It was possible to conclude that the use of Modified Dixon Agar is important in the laboratory routine for microbiological diagnosis of canine and feline otitis, extending the range of Malassezia species diagnosed. Direct examination proved to be a good indicator of the presence of yeast, but not enlightening regarding its involvement in the infection. In addition, these yeasts have high enzymatic activity in vitro and may be part of the pathogenesis of microbial otitis, even when it is not the main pathological agent, as in co-infections otitis even with low isolation counts. Key words malasseziosis, microbiological diagnosis, fungal infection