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Fatores de transcrição envolvidos com a ativação dos receptores de progesterona durante o diestro não gestacional de cadelas

FRANCISLAINE ANELIZE GARCIA SANTOS.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-213956

Resumo

Resumo: A função do corpo lúteo na cadela foi abordada em vários estudos, visando a identificação de mecanismos luteotróficos e luteolíticos, porém a regressão luteínica na cadela cíclica ainda não foi bem caracterizada, assim como todos os fatores luteotróficos. Sabe-se que a progesterona (P4) é um fator luteotrófico capaz de ativar receptores nucleares de progesterona (PGRs) e exerce diferentes atividades sobre regiões promotoras de genes responsivos à progesterona, aumentando ou diminuindo a transcrição dos genes a depender da disponibilidade de fatores de transcrição em células-alvo. O objetivo do trabalho foi caracterizar a expressão gênica do PGR, seus fatores de transcrição com sítios de ligação ao PGR, o AP-1, o FOXO3 e o HOXA5 e os genes StAR, CYP11A1, HSD3B2, responsivos ao PGR, no corpo lúteo (CL) canino. Foram utilizados CLs provenientes de cadelas que passaram por ovariosalpingohisterectomia nos dias 10, 20, 30, 40, 50 e 60 após a ovulação (p.o). Para determinação do D0 foram realizadas coletas de sangue para dosagem da P4. Os CLs coletados foram utilizados para extração de RNA total a partir do protocolo de TRIZOL e posterior análise por RNA-Seq seguindo o protocolo TruSeq RNA Sample Preparation e validação dos genes por PCR em tempo real. Avaliamos in vitro os efeitos do silenciamento de PGR pela técnica de RNA de interferência (RNAi) e em células estimuladas com P4 para os genes alvos. Após as validações, os resultados obtidos foram testados, através do programa SAS, de acordo com sua homogeneidade e normalidade, e apresentados como média ± EPM, diferenças de p 0,05 foram consideradas significativas. Houve o aumento de AP-1 e FOXO3 nas células com adição de P4 (500 ng/mL) e nas silenciadas com siRNA PGR. A análise de RNA-Seq mostrou o aumento de AP-1 no dia 30 p.o e a análise de qPCR mostrou o aumento de FOXO3 no dia 40 p.o. A análise de RNA-Seq indicou um aumento de HOXA5 no dia 40 p.o e no silenciamento de PGR uma diminuição de HOXA5. Os resultados sugerem que o aumento de AP-1 possa regular positivamente a formação do CL durante diestro e o aumento de HOXA5 possa regular negativamente. A ativação de FOXO3 parece estar evolvida tanto na proliferação quanto na regressão, de acordo com os estímulos hormonais nesta fase. Sugere-se que a ligação da P4 ao PGR ative a transcrição de genes envolvidos com os processos de proliferação e regressão do CL. Assim, concluímos que o receptor de progesterona é responsivo a fatores de transcrição e influencia a expressão de enzimas esteroidogênicas, exercendo papel na regulação da proliferação e sobrevivência celular do corpo lúteo durante o diestro.
Abstract: The function of the corpus luteum in the dog has been approached in several studies aiming the identification of luteotrophic and luteolytic mechanisms, but luteal regression in the cyclic bitch has not been well characterized, as well as all luteotrophic factors. Progesterone (P4) activates the progesterone receptor (PGR) and exerts different activities on promoters of progesterone-responsive gene, and the specificity of transcription depends on the availability of transcription factors in target cells. The objective of this work was to characterize the expression of P4 receptor, as well as transcription factors with PGR binding sites, AP-1, FOXO3 and HOXA5 and StAR, CYP11A1, HSD3B2, genes responsive to PGR, in the canine corpus luteum (CL). The CLs from bitches undergoing ovariosalpingohisterectomy at days 10, 20, 30, 40, 50 and 60 after ovulation (p.o) were used. Blood samples were collected for P4 measurement. The collected CLs were used for total RNA extraction from using the TRIZOL protocol and further RNA-seq analysis was carried out following the TruSeq RNA Sample Preparation protocol. Gene validation was by real time PCR. We evaluated in luteal cell culture the effects of PGR silencing by interference RNA technique (RNAi) and accessed the target genes. After validations, the results obtained were tested by the SAS program, according to their homogeneity and normality, and presented as mean ± SEM, differences of p 0.05 were considered significant. There was an increase of AP-1 and FOXO3 in cells with addition of P4 and silenced with PGR siRNA. RNA-Seq analysis showed an increase in AP-1 on day 30 p.o and qPCR analysis showed an increase in FOXO3 on day 40 p.o. RNA-Seq analysis indicated an increase in HOXA5 on day 40 p.o and PGR silencing a decrease in HOXA5. The results suggest that AP-1 increase can up-regulate CL formation during diestrus canine and HOXA5 increase can down-regulate. The FOXO3 participates of these processes according to hormonal stimuli that occur during diestrus canine. Thus, we conclude that the PGR is responsive to specific transcription factors and modulates the expression of steroidogenic enzymes, playing a role in regulating cell proliferation and survival of the corpus luteum during diestrus. Progesterone. Progesterone nuclear receptor. Transcriptional regulator. Sequencing. Gene silencing. Luteal cell. Dog.
Biblioteca responsável: BR68.1