Inseminação artificial em tempo fixo e produção in vitro de embriões : avanços na reprodução de bovinos

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi estudar estratégias para incrementar a eficiência das biotecnologias de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) e produção in vitro de embriões (PIVE), através da I) Utilização da diluição de sêmen pós-descongelamento na IATF e PIVE; II) Suplementação do meio de maturação e cultivo in vitro com diferentes concentrações de Peptídeo Natriurético C (NPPC); e III) Avaliação do perfil lipídico de embriões Bos indicus produzidos in vitro com diferentes quantidades de folículos antrais. No experimento I foram utilizadas palhetas de sêmen de um único touro com fertilidade previamente conhecida foram utilizadas no grupo controle e grupo diluição (diluição de uma palheta em duas utilizando o produto comercial Prosemen®). A taxa de concepção foi semelhante (P = 0,517) entre o diluidor (52,11%) e controle (55,48%), mas o grupo com diluente apresentou uma redução no número de doses utilizadas por concepção (0,95 diluidor vs. 1,80 controle; P <0,001). Não foi observado diferença na PIVE, taxa de fertilização oocitária, motilidade total e progressiva na análise espermática. No experimento II foi avaliado a suplementação com NPPC na maturação in vitro (MIV; 50 nM, 100 nM ou 150 nM) ou no cultivo in vitro (CIV; 50 nM, 100 nM ou 150 nM) em comparação a um grupo controle (sem suplementação). As taxas de blastocistos não diferiram entre os grupos (P?0,05). Para os genes analisados observamos diferença somente na expressão de REST, gene relacionado a pluripotência e desenvolvimento embrionário, com maior expressão no grupo 150 nM MIV. Para os genes relacionados ao metabolismo (AKR1B1, SCD e SREBF1), maturação oocitária e desenvolvimento folicular (BMP15 e GDF9), sinalização Celular, estresse oxidativo e térmico (FOXO3, HSF1 e HSPA1A), pluripotência (POU5F1 e NANOG), desenvolvimento embrionário (HAND1, GPX1, STAT3 e VEGFA), interação materno-fetal (IFNT2 e PTGS2/COX-2), regulação epigenética (Dnmt3? e Dnmt3?) e receptor do NPPC (NPR2) não foi demonstrado diferença entre os grupos. Adicionalmente, foi demonstrado pela primeira vez a expressão do receptor de NPPC (NPR2) em embriões. No experimento III foi investigar se a quantidade de folículos antrais (FAs) influencia o perfil lipídico (análise do perfil lipídico pela técnica DESI-MS) de embriões produzidos in vitro de fêmeas Bos taurus indicus. Para o cultivo in vitro foram utilizados ovários (n = 498) de 249 fêmeas Nelore, coletados de abatedouro local e transportados em solução salina a 30-35º C até o laboratório. Os animais foram classificados em grupo de baixa (?31; média menos DP) e alta quantidade de FAs (?92; média mais DP). As taxas de clivagem e blastocisto, não apresentaram diferenças entre os grupos (78,9% e 41,7% no grupo de alta; n= 419 oócitos; 79,5% e 40,3% no grupo de baixa; n= 357 oócitos; P?0,05). O perfil lipídico de embriões derivados de vacas com maior quantidade de FAs apresentaram uma maior concentração de lipídios triacilgliceróis e menor de derivados de colesterol e diacilgliceróis, quando comparados aos embriões de vacas com menor quantidade de FAs. Em conclusão, I) o uso do diluidor pós-descongelamento reduziu o número de doses por concepção, reduzindo o custo por prenhez na IATF; II) Embora as taxas de blastocisto não tenham diferido entre os grupos, o gene REST relacionado a pluripotência e desenvolvimento embrionário teve maior expressão em 150MIV, fornecendo referências para a melhoria dos resultados de MIV; III) Nossos resultados demonstraram diferenças no perfil lipídico nos embriões PIV quando analisamos diferentes quantidades de FAs, porém não foi possível avaliar sua interferência significativa nas taxas de clivagem e blastocistos.

ABSTRACT

The objective of this study was to evaluate strategies to increase the efficiency of biotechnology Timed Artificial Insemination (TAI) and in vitro embryo production (IVP) through I) Use of post-thaw dilution of semen in IATF and IVP; II) Supplementation of the in vitro culture and maturation medium with different concentrations of Natriuretic Peptide C (NPPC); and III) Influence of the amount of antral follicles on the lipid profile of embryos Bos indicus produced in vitro. In the experiment I were used semen straws of a single bull with previously known fertility were used in the control group and dilution group (dilution of one straw in two using commercial product Prosemen®). The conception rate was similar (P = 0.517) between the diluent (52.11%) and control group (55.48%), but the diluent group showed a reduction in the number of doses used per conception (0.95 diluent vs 1.80 control, P <0.001). No difference was observed in IVP, oocyte fertilization rate, total and progressive motility in sperm analysis. In Experiment II, NPPC supplementation in vitro maturation (IVM; 50 nM, 100 nM or 150 nM) or in vitro culture (IVC; 50 nM, 100 nM or 150 nM) was evaluated in comparison to a control group (without supplementation). Blastocyst rates did not differ between groups (P?0.09). For the genes analyzed, we observed a significant difference only in the expression of REST, a gene related to pluripotency and embryonic development, with higher expression in the 150 nM IVM group. For the genes related to metabolism (AKR1B1, SCD and SREBF1), oocyte maturation and follicular development (BMP15 and GDF9), cell signaling, oxidative and thermal stress (FOXO3, HSF1 and HSPA1A), pluripotency (POU5F1 and NANOG), embryonic development HAND1, GPX1, STAT3 and VEGFA), maternal-fetal interaction (IFNT2 and PTGS2 / COX-2), epigenetic regulation (Dnmt3? and Dnmt3?) and NPPC receptor (NPR2) showed no difference between groups. Additionally, the expression of the NPPC receptor (NPR2) in embryos has been demonstrated for the first time. In experiment III it was investigated if the number of antral follicles (AFs) influences the lipid profile (DESI-MS lipid profile analysis) of embryos produced in vitro of Bos taurus indicus females. For in vitro culture, ovaries (n = 498) of 249 Nelore females were collected from a local slaughterhouse and transported in saline at 30-35º C until laboratory. The animals were classified as low (?31, mean less SD) and high number of AFs (?92, mean plus SD). The cleavage and blastocyst rates did not differ between the groups (78.9% and 41.7% in the high group, n = 419 oocytes, 79.5% and 40.3% in the low group, n = 357 oocytes; P?0,05). The lipid profile of embryos derived from cows with higher AFs presented a higher lipid concentration triacylglycerols and lower cholesterol derivatives and diacylglycerols when compared to the embryos of cows with a lower amount of AF. In conclusion, I) the use of the post-thaw diluent reduced the number of doses per conception, reducing the pregnancy cost in TAI; II) Although blastocyst rates did not differ between groups, the REST gene related to pluripotency and embryonic development had greater expression in 150MIV, provide references for the improvement of IVM results; III) Our results demonstrate differences in the lipid profile in the PIV embryos when we analyzed different amounts of AFs, but it was not possible to evaluate their significant interference in the rates of cleavage and blastocysts.