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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-213997

Resumo

SOUZA, A. P. Transferência gênica de fibroblastos, oócitos e embriões suínos mediada por polietilenoimina. 2019. 87p. Tese (Doutorado em Ciência Animal. Área: Produção Animal) Universidade do Estado de Santa Catarina. Programa de Pós-graduação em Ciência Animal, Lages, 2019. Diferentes metodologias são utilizadas para produzir suínos transgênicos, entre elas estão microinjeção pronuclear, transferência gênica mediada por espermatozoide, microinjeção de vetores retrovirais em oócitos, transferência nuclear de células somáticas previamente modificadas. Todos esses métodos foram capazes de produzir com sucesso suínos transgênicos. Porém, ainda apresentam limitações, como a baixa integração do transgene e baixo percentual de animais produzidos, ainda, algumas são caras e laboriosas. Assim, torna-se relevante o desenvolvimento de métodos e padronizações que aumentem a eficiência e melhorem a relação custo-benefício da produção de suínos geneticamente modificados. A Polietilenoimina (PEI) é um polímero catiônico, que condensa o DNA em partículas carregadas positivamente, formando complexos que se ligam aos resíduos de superfície aniônicos e são levados para dentro da célula por endocitose. Tem-se descrito o uso da PEI como um bom agente transfectante numa ampla gama de tipos celulares, apesar disso, até o momento não há um protocolo desenvolvido para este polímero visando a transfecção de células na espécie suína. Diante disto, o objetivo do presente trabalho desenvolver protocolos de transfecção celular eficiente para fibroblastos fetais, oócitos e embriões suínos. Para isso, o presente trabalho foi realizado em duas etapas. A etapa I consistiu no desenvolvimento de um protocolo para de transfecção gênica para fibroblastos fetais suínos (FFS). Para isso foram conduzidos 3 experimentos. No experimento 1 foi avaliada a capacidade da PEI de ser internalizada em diferentes concentrações (0,625; 1,25; 2,5; 5; 10; 20; 40 e 80g/mL) por incubação em diferentes períodos (0,5, 1 e 2 horas). O experimento 2 foi realizado para determinar a melhor razão polímero/eDNA, sendo o grau de complexação avaliado por eletroforese em gel de agarose. No experimento 3, a transfecção foi realizada baseada nos resultados dos experimentos anteriores. Para a transfecção, foram utilizadas as concentrações 10 e 40g/mL, a razão N/P igual a 2, por um período de incubação de 0,5h. Não foi verificada diferença entre as concentrações de PEI utilizadas na porcentagem de células positivas para GFP, no entanto, a concentração de 40g/mL causou maiores danos as células transfectadas. Além disso, a GFP foi expressa por um período de 3 dias, o que sugere que o plasmídeo atingiu o núcleo dos fibroblastos, tendo o gene sido expresso de forma não transiente. A etapa II, consistiu no desenvolvimento de um protocolo para de transfecção gênica para oócitos e embriões suínos. Nesta etapa foram conduzidos 2 experimentos. No experimento 1 foi avaliada a capacidade da PEI de ser internalizada em diferentes concentrações (10; 20; 40 e 80g/mL). No experimento 2, baseado nos resultados do experimento 1, as transfecções foram realizadas utilizando as concentrações 20 e 80g/mL, a razão de PEI/ eDNA igual a 2, por 0,5h de incubação. Nesta etapa foi demostrado que a PEI, diferente de outros agentes transfectantes, tem a capacidade de passar a zona pelúcida, sendo o protocolo desenvolvido foi capaz de produzir blastocistos transgênicos para GFP, tanto de oócitos e embriões transfectados. Os resultados apresentados neste trabalho mostram que através da transfecção gênica mediada pela polietilenoimina foi possível gerar fibroblastos e blastocistos suínos transgênicos para proteína verde fluorescente de forma eficiente.

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SOUZA, A. P. Polyethyleneimine-mediated gene transfer in swine fibroblast, oocyte and embryos. 2019. 87p. Doctoral Thesis in Animal Science. Area of concentration: Animal Production Santa Catarina State University. Animal Science Postgraduate Program, Lages, 2018. Different methodologies are used to produce transgenic pigs, among them are pronuclear microinjection, sperm-mediated gene transfer, microinjection of retroviral vectors into oocytes, and nuclear transfer of previously modified somatic cells. These methods are able to successfully produce transgenic pigs. However, limitations such as low transgene integration and low percentage of animals produced, furthermore some are expensive and laborious. The development of methods and standards increases the efficiency and improve the cost-benefit ratio of genetically modified pig production becomes relevant. Polyethyleneimine (PEI) is a cationic polymer which condenses the DNA into positively charged particles forming complexes that bind to the anionic surface residues and are carried into the cell by endocytosis. The use of PEI as a transfectant agent in a wide range of cell types has been described, however, so far has not been yet a protocol developed for this polymer to transfect of cells into the swine species. In view of this, the objective of the present work was to develop efficient cellular transfection protocols for fetal fibroblasts, oocytes and swine embryos. The present work was carried out in two stages. Stage I consisted of the development of a protocol for gene transfection for swine fetal fibroblasts (FFS). Therefore, 3 experiments were conducted. In the experiment 1, the capacity of the PEI to be internalized at different concentrations (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 and 80g / mL) by incubation at different periods (0.5, 1 and 2 hours). Experiment 2 was performed to determine the best polymer / eDNA ratio, and the degree of complexation was evaluated by agarose gel electrophoresis. In experiment 3, transfection was performed based on the results of the above experiments. For transfection, the concentrations 10 and 40 g / mL were used, the N / P ratio was 2, for an incubation period of 30 minutes. No difference was found between the concentrations of PEI used in the percentage of GFP positive cells, however, the concentration of 40 g / ml caused greater damage to the transfected cells. In addition that, GFP was expressed for a period of 3 days, suggesting that the plasmid reached the fibroblast nucleus, and the gene was expressed non-transiently. Stage II consisted of the development of a protocol for gene transfection for oocytes and swine embryos. In this stage 2 experiments were conducted. In the experiment 1, the capacity of the PEI to be internalized in different concentrations (10; 20; 40 and 80g/mL) was evaluated. In experiment 2, based on the results of experiment 1, transfections were performed using concentrations of 20 and 80g / mL, the PEI / eDNA ratio was 2, for 0,5 hours of incubation. In this step it was demonstrated that PEI, unlike other transfecting agents, has the ability to pass the zona pellucid, and the protocol developed was able to produce transgenic blastocysts for GFP, both oocytes and transfected embryos. The results presented in this work show that through polyethyleneimine-mediated gene transfection it was possible to generate transgenic fibroblasts and swine blastocysts to efficiently express fluorescent green protein.

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