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Criopreservação de tecido testicular de cães (Canis lupus familiaris)

JOSE FABSON PINHEIRO DOS SANTOS.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-215560

Resumo

A formação de um banco de germoplasma apresenta-se como uma importante ferramenta para a conservação da linhagem germinativa de animais de alto valor zootécnico, bem como de espécies ameaçadas de extinção. A criopreservação de tecidos é mais uma estratégia eficiente para contribuir com as ferramentas de conservação de gametas. Embora, não exista relato sobre a criopreservação de fragmentos testicular caninos na literatura, o cão doméstico apresenta-se como um bom modelo experimental para os canídeos ameaçados de extinção. O objetivo geral foi verificar a possibilidade de conservação de material genético de cães através da criopreservação de tecido testicular por vitrificação e congelação em duas etapas. Foram utilizados testículos de animais pós-púberes sem raça definida (n=20 pares) provenientes do Centro de Controle Ambiental de Garanhuns, Pernambuco, Brasil. Após a orquiectomia bilateral, os testículos foram submetidos ao processo de criopreservação pelo método de vitrificação e duas etapas, os quais foram testados dois crioprotetores (dimetilsulfóxido e etilenoglicol) e a associação de ambos, em dois diferentes tempos de imersão (15 e 30 minutos). Os protocolos foram avaliados quanto à integridade de membrana e cromatina, bem como do tecido (células intratubulares e epitélio). O n amostral foi calculado em R (3.2.3) baseado nos principais trabalhos realizado em felinos. Os dados foram submetidos ao teste de normalidade de Shapiro-Wilk, e as médias foram comparadas pelo teste de Wilcoxon. A associação entre dimetilsulfóxido e etilenoglicol trouxe melhor qualidade pós congelação para integridade de membrana e cromatina, bem como melhor visualização dos nucléolos. Com relação ao método de congelação, na maioria das avaliações o método de congelação rápida (duas etapas) trouxe melhores resultados, menor condensação de núcleos e melhor visualização dos nucléolos. Já a congelação ultrarrápida, a vitrificação, apresentou melhor conservação do tecido epitelial. Esse estudo mostrou a superioridade na combinação dos dois agentes crioprotetores, o dimetilsulfóxido e etilenoglicol em associação com método de duas etapas. Embora a vitrificação de tecido testicular de cães não tenha mostrado grandes resultados como o método de duas etapas, esse é um método excelente e prático capaz de contribuir para a conservação do germoplasmas. No entanto, esses são resultados primários em caninos, portanto, mais estudos são necessários para adaptação do protocolo. Ademais, ambos os tempos de imersão foram eficientes para os prcedimentos de conservação de tecido.
Creating a germplasm bank is an important tool for germ cell conservation, mainly from animals of high zootechnical value as well as endangered species. Tissue cryopreservation is another efficient strategy to contribute with tools of gamete conservation. Although there is no report on cryopreservation of canine testicular fragments in the literature, the domestic dog presents a good experimental model for endangered canids. General objective was to verify the possibility of preservation of dog genetic material through the cryopreservation of testicular tissue by vitrification and two-step-freezing method. It was used testicles from post pubertal animals with no defined breed (n = 20 pairs) from the Environmental Control Center of Garanhuns, Pernambuco, Brazil. After bilateral orchiectomy, testicles were submitted to cryopreservation process by the vitrification method and two-step-freezing using two cryoprotectants (dimethylsulfoxide and ethylene glycol) in two different immersion times (15 and 30 minutes). Protocols were evaluated about membrane and chromatin integrity as well as tissue (intratubular cells and epithelium). For statistical analysis the number was calculated with 95% of confidence level, obtained data were subjected to normality test by Shapiro-Wilk. Wilcoxon-Test was used to compare treatments (P<0,05). The combination between dimethylsulfoxide and ethylene glycol presented better post-freezing quality for membrane and chromatin integrity and a better visualization of the nucleoli. Regarding the freezing method, in the most of evaluations the rapid freezing method (two-steps-freezing) showed better results, less condensation of nuclei and better visualization of the nucleoli. The ultrarrapid freezing, vitrification, presented better preservation of the epithelial tissue. This study shows a superiority on the combination of dimethyl sulphoxide and ethylene glycol cryoprotectant agents in association with twostep-freezing method. Although vitrification did not show great results two-step-freezing method, it is an excellent practical method able to contribute to germoplasm conservation. Nevertheless, those are primo results for dogs, more studies must be performed for protocol adaptation. In addition, both times of immersion were efficient for tissue conservation procedures.
Biblioteca responsável: BR68.1