ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA EM SUÍNOS NORMAIS E AFETADOS COM HÉRNIA ESCROTAL

RESUMO

A hérnia escrotal é uma malformação congênita frequente na produção de suínos, caracterizada pela abertura anormal do anel inguinal e que permite a passagem de alças intestinais ao saco escrotal. Essa condição inicia-se no período fetal e envolve modificações anatomofisiológicas da descida testicular. A hérnia causa dor, desconforto e reduz o desempenho do animal afetado, acarretando grandes perdas econômicas na suinocultura. Buscou-se, portanto, identificar genes relacionados com a ocorrência desta patologia por meio de estudos de expressão gênica quantitativa (qPCR) no tecido do anel inguinal de suínos normais e afetados com hérnia escrotal. Primeiramente, a estabilidade de expressão de 10 genes normalmente utilizados como referência foi analisada em diferentes condições experimentais 1) leitões com 30 dias de idade da linhagem MS115 e 2) suínos de 60 dias de idade da raça Landrace. Amostras teciduais do anel inguinal foram colhidas após eutanásia dos leitões, congeladas em nitrogênio líquido e submetidas à extração do RNA total e síntese de cDNA. Os resultados de expressão gênica dos grupos amostrais foram analisados por meio das ferramentas geNorm (SLqPCR), NormFinder, BestKeeper e método Ct e uma listagem geral foi estabelecida com o uso da ferramenta BruteAggreg. Os genes RPL19, RPL32 e H3F3A demonstraram as melhores estabilidades de expressão aos 30 dias e o PPIA e RPL19 aos 60 dias de idade e foram considerados adequados genes de referência para as condições estudadas. Posteriormente, foram avaliados 17 genes candidatos para a ocorrência da hérnia escrotal, a partir de amostras teciduais de 18 suínos machos inteiros da raça MS115 com 30 dias de idade, agrupados em normais (n=9) e afetados (n=9) com hérnia escrotal. Os genes escolhidos para a análise de expressão foram identificados em estudo prévio do transcriptoma do anel inguinal de suínos com 60 dias de idade, normais e afetados com hérnia escrotal. Considerando o nível de expressão no transcriptoma e algumas funções biológicas, 17 genes alvos foram avaliados MYH1, DES, TNNI1, ACAN, ACTG2, ACTA1, FGF1, MMP1, FMOD, FBN2, ADCY5, MYBPC1, MAP1LC3C, GUSB, MYH7, COL23A1 e CNN1. Os primers para cada gene foram desenhados a partir da sequência do genoma suíno (Sus scrofa) depositada no GenBank. A quantificação relativa dos genes alvos foi realizada por qPCR e os valores do ciclo de amplificação (Cts) dos genes foram obtidos. O programa REST® (Relative Expression Software Tool) foi utilizado para comparar a expressão gênica entre os grupos experimentais por meio de uma análise não paramétrica e os genes RPL19, RPL32 e H3F3A foram utilizados como constitutivos. Os genes MYH1, DES e TNNI1 (p0,05) e ACTA1 e MYH7 (p0,08) apresentaram menores níveis de expressão no grupo afetado comparado ao grupo controle. A menor expressão destes genes nos animais afetados pode estar relacionada ao aparecimento da hérnia escrotal em suínos pela reduzida capacidade de sustentação na região inguinal. Esses resultados contribuem para o melhor entendimento do mecanismo genético envolvido no aparecimento da hérnia escrotal.

ABSTRACT

The scrotal hernia is a common congenital malformation in pig production, characterized by the abnormal opening of the inguinal ring, which allows the passage of intestinal loops to the scrotal sac. This condition begins in the fetal period and involves anatomopathological changes of the testicular descent. Hernia causes pain, discomfort and reduces the performance of the affected animal, causing great economic losses in pig production. Therefore, we aimed to identify genes related to the occurrence of this pathology through quantitative gene expression (qPCR) in the inguinal ring/canal tissue of normal and scrotal hernia-affected pigs. Firstly, the expression stability of 10 genes normally used as reference was analyzed under different experimental conditions 1) MS115 30 days-old piglets and 2) Landrace 60 days-old pigs. After the piglets euthanasia, the inguinal tissue samples were collected, frozen in liquid nitrogen and subjected to total RNA extraction and cDNA synthesis. The gene expression results were analyzed using the geNorm (SLqPCR), NormFinder, BestKeeper and the Ct method tools, and a general rank was established using the BruteAggreg tool. The RPL19, RPL32 and H3F3A genes demonstrated the best expression stability at 30 days and the PPIA and RPL19 at 60 days of age, being considered suitable reference genes for the conditions studied. Moreover, 17 candidates genes for the occurrence of scrotal hernia were evaluated from tissue samples of 18 30-days-old MS115 entire male piglets, grouped in normal (n=9) and affected (n=9) with scrotal hernia. The genes chosen for the expression analysis were identified in a previous study of the inguinal ring transcriptome of 60 days-old pigs, normal and affected with scrotal hernia. Considering the level of expression in the transcriptome and biological functions, 17 genes were evaluated MYH1, DES, TNNI1, ACAN, ACTG2, ACTA1, FGF1, MMP1, FMOD, FBN2, ADCY5, MYBPC1, MAP1LC3C, GUSB, MYH7, COL23A1 end CNN1. The primers for each gene were drawn from the swine genome sequence (Sus scrofa) deposited in the Ensembl. The relative quantification of the target genes was performed by qPCR and the genes amplification cycle (Cts) values were obtained. The REST® program (Relative Expression Software Tool) was used to compare the experimental groups with a non-parametric analysis and the genes RPL19, RPL32 and H3F3A were used as housekeeping genes. The MYH1, DES and TNNI1 (p0.05) and ACTA1 and MYH7 (p0.08) genes were downregulated in the affected compared to the control group. The lower expression of these genes in the affected animals can be related to the appearance of scrotal hernia in pigs by the reduced support in the inguinal region. These results contribute to a better understanding of the genetic mechanism involved in the development of scrotal hernias.