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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216015

Resumo

O presente estudo teve como objetivo avaliar a estabilidade dos genes candidatos a referência Cancer Susceptibility Candidate 3 (CASC3), Eukaryotic Translation Elongation Factor 1 Alpha 2 (EEF1A2), Hydroxymethylbilane Synthase (HMBS), 18S Ribosomal RNA (18S), Actin Beta (ACTB), Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH) e Ubiquitin C (UBC), e selecionar os genes mais estáveis nos tecidos: fígado, músculo esquelético e jejuno de novilhos puros (Nelore) ou cruzados (Nelore x Angus) sob diferentes dietas para serem utilizados em análises de RT-qPCR. Além disso, para validar a seleção de genes de referência candidatos, a expressão dos genes alvos Maltase-Glucoamylase 2 (MGAM), Solute Carrier Family 2 Member 1 (SLC2A1), Stearoyl-CoA Desaturase (SCD), Acyl-CoA Oxidase 1 (ACOX1) e Fatty Acid Synthase (FAS) foram avaliadas usando os diferentes genes. Foram utilizados 14 novilhos puros e 14 cruzados, sendo que metade dos animais de cada grupo genético recebeu uma dieta contendo grãos de milho inteiro (GMI) e a outra metade grãos de milho inteiro e bagaço de cana de açúcar (GMIB). A análise de estabilidade foi realizada por meio do programa online RefFinder, que combina os algoritmos GeNorm, NormFinder, Bestkeeper e Delta-Cq. A ACTB esteve entre os três genes mais estáveis para cada tecido avaliado, já para os demais genes a estabilidade e a inclusão dos genes se alteraram a depender do tecido e raça. Os genes mais estáveis foram o 18S, ACTB e CASC3 para o músculo; para o fígado, HMBS, ACTB e 18S; e para o jejuno GAPDH, ACTB e CASC3, independente de raça e dieta. Ao se comparar os genes mais estáveis e menos estáveis como referência para normalização dos genes alvos FAS, ACOX1, MGAM e SCD, elucidou-se possíveis erros causados na análise dos dados. A utilização dos conjuntos de genes de referência mais estáveis e menos estáveis podem levar a diferentes conclusões a respeito do perfil de expressão do gene alvo estudado. Os resultados encontrados na validação dos genes de referência reforça o fato de que a seleção dos genes de referência mais adequados para cada experimento é de suma importância para garantir a confiabilidade dos estudos de expressão gênica para que possam ser aplicados na prática. Assim, o estudo demonstra a importância de se fazer análises prévias para cada condição experimental a ser estudada.

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The objective of the present study was to evaluate the stability of reference candidate genes Cancer Susceptibility Candidate 3 (CASC3), Eukaryotic Translation Elongation Factor 1 Alpha 2 (EEF1A2), Hydroxymethylbilane Synthase (HMBS), 18S Ribosomal RNA (18S), Actin Beta ), Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH) and Ubiquitin C (UBC), and to select the most stable genes in the tissues: liver, muscle and jejunum of purebred (Nellore) or crossbred (Nellore x Angus) steers under different diets to be used in RT-qPCR analyses. In addition, to validate the selection of candidate reference genes, expression of the target genes Maltase-Glucoamylase 2 (MGAM), Solute Carrier Family 2 Member 1 (SLC2A1), Stearoyl-CoA Desaturase (SCD), Acyl-CoA Oxidase 1 ( ACOX1) and Fatty Acid Synthase (FAS) were evaluated using the different genes. Fourteen Nellore steers and fourteen crossbred steers were used, with half of the animals in each genetic group were fed a diet containing whole shelled corn (GMI) and the other half whole shelled corn and sugarcane bagasse (GMIB). Stability analyses was performed through the online program RefFinder, which combines the algorithms GeNorm, NormFinder, Bestkeeper and Delta-Cq. The ACTB was among the three most stable genes for each tissue evaluated, and for the other genes the stability and inclusion of the genes have changed depending on tissue and breed. For the muscle, the most stable genes were 18S, ACTB and CASC3; for the liver, HMBS, ACTB and 18S; and for the jejunum GAPDH, ACTB and CASC3, regardless of breed and diet. The use of the most stable and less stable genes as reference for normalization of the target genes FAS, ACOX1, MGAM and SCD may change RT-qPCR results causing errors in the analyses of the data. The use of more stable and less stable reference gene sets may lead to different conclusions about the expression profile of the target gene studied. The results found in the validation of the reference genes reinforce the fact that the selection of the most suitable reference genes for each experiment is of paramount importance to ensure the reliability of the gene expression studies so that they can be applied in practice. Thus, the study demonstrates the importance of making previous analyzes for each experimental condition to be studied.

Biblioteca responsável: BR68.1