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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216269

Resumo

A utilização da técnica de resfriamento como ferramenta biotecnológica na área de aquicultura ainda carece de estudos a fim de verificar a viabilidade de sua aplicação, principalmente para espécies de invertebrados de interesse comercial. Assim, o presente trabalho teve como objetivo investigar os efeitos do resfriamento em embriões de Macrobrachim amazonicum em estádio final de desenvolvimento. Para tanto foram realizados pools de embriões coletados de fêmeas de camarão-da-amazônia, e realizados os seguintes grupos de tratamento: dimetilsulfóxido (DMSO) 3% + sacarose (SAC) 2M; etilenoglicol (EG) 0,5% + SAC 2M. Estes foram submetidos diretamente a temperatura de 2 ºC por 2 e 6 h de estocagem, e após período de resfriamento, foram lavados e levados a incubadoras por 24h. Os embriões foram fotografados antes, após resfriamento e após 24h nas incubadoras, para verificação de volume embrionário e sobrevivência. A partir de outro pool de embriões, foram realizados os seguintes grupos de tratamento: DMSO 3% + SAC 1M; EG 0,5% + SAC 1M. Estes foram submetidos a curva de resfriamento direta, 1ºC/min e 0,5ºC/min, até atingirem a temperatura de 2ºC por 2h. Em seguida, foram lavados e levados a incubadoras por 24h. A sobrevivência foi verificada após a estocagem de 2h e após 24h nas incubadoras. Amostras de embriões resfriados com DMSO 3% + SAC 2M e EG 0,5% + SAC 2M, submetidos a curva de resfriamento de 0,5º/min, foram fixadas e pós-fixadas para realização de microscopia eletrônica de varredura (MEV) com e sem a utilização de secadora de ponto crítico. A análise de sobrevivência e as fotografias para verificação de volume embrionário foram realizadas em microscópio estereoscópico Leica DFC 295 acoplado a equipamento de fotomicrografia no programa LAS V3.6. Os dados de sobrevivência e de volume embrionário foram submetidos análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey, com nível de significância de 5%. Embriões tratados com DMSO 3% e EG 0,5% associados com SAC 2M, apresentaram sobrevivência de 84,8 ± 3,9 e 79,7 ± 2,8%, respectivamente. Após 24 h, estas taxas reduziram para 71,7 ± 6,6% e 66 ± 6.9%, respectivamente. Não foi observada diferença estatística significativa nos tratamentos quanto ao volume embrionário, mas foi possível observar mudança na transparência dos embriões para uma coloração esbranquiçada opaca ou marrom. Foi possível verificar taxas de sobrevivência de 83,3 ± 4% e 81,1 ± 3,3% para os grupos tratados em curva direta com DMSO 3%+ SAC 1M and EG 0,5% + SAC 1M, respectivamente. Os embriões analisados em MEV, sem utilização de secadora de ponto crítico, apresentaram intenso enrugamento na membrana coriônica, mas sem rompimento. Nos embriões analisados com secadora de ponto crítico foi possível observar que a membrana coriônica embora destruída na maioria das amostras, não apresentou enrugamento. Assim, pode-se constatar que a sobrevivência é inversamente proporcional ao tempo de estocagem, e a mudança na coloração observada está relacionada a formação de cristais de gelo. Em futuros experimentos devem-se avaliar soluções de descongelamento, novos protocolos para MEV a fim de testar a viabilidade de embriões e de larvas desta espécie para criopreservação.

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The use of the cooling technique as a biotechnological tool in the aquaculture area still lacks studies to verify the feasibility of its application, mainly for invertebrate species of commercial interest. Thus, the present work had as objective to investigate the effects of the cooling in Macrobrachim amazonicum embryos. Embryo pools collected from Amazonian shrimp females were performed and the following treatment groups were performed: 3% dimethylsulfoxide (DMSO) + 2 M sucrose (SAC); 0.5% ethylene glycol (EG) + 2M SAC. These were submitted directly to 2 °C for 2 and 6 h of storage, and after cooling, they were washed and taken to incubators for 24 hours. The embryos were photographed before, after cooling and after 24 hours in the incubators, to verify embryonic volume and survival. From another pool of embryos, the following treatment groups were performed: 3% DMSO + 1M SAC; EG 0.5% + 1M SAC. These were submitted to the direct cooling curve, 1 ºC / min and 0.5 ºC/min, until reaching the temperature of 2 ºC for 2h. They were then washed and taken to incubators for 24 hours. Survival was verified after storage of 2 h and after 24 h in incubators. Embryo samples cooled with 3% DMSO + 2M SAC and 0.5 % EG + 2M SAC, submitted to a cooling curve of 0.5 ºC/min, were fixed and postfixed for scanning electron microscopy (SEM) with and without using a critical point dryer. Survival analysis and embryo volume verification photographs were performed on a Leica DFC 295 stereomicroscope coupled to photomicrography equipment in the LAS V3.6 program. Survival and embryo volume data were submitted to analysis of variance (ANOVA) and Tukey's test, with significance level of 5%. Embryos treated with 3% DMSO and 0.5% EG associated with 2M SAC, presented survival of 84.8 ± 3.9 and 79.7 ± 2.8%, respectively. After 24 h, these survivals decreased to 71.7 ± 6.6% and 66 ± 6.9%. There was no significant statistical difference in the treatments regarding the embryonic volume, but it was possible to observe a change in the transparent condition of the embryos to a whitish opaque or brown coloration. Regarding the cooling curves applied, it was possible to verify the survival rate of 83.3 ± 4% and 81.1 ± 3.3% for the groups treated with a direct curve with 3% DMSO + 1M SAC and 0.5% EG + 1M SAC, respectively. The embryos analyzed in SEM without the use of a critical point dryer presented intense wrinkling in the chorionic membrane, whereas with a critical point dryer, a better preservation of the chorionic membrane was observed in an embryo, but most of the embryos had their membranes destroyed. Thus, it was possible to conclude that survival is inversely proportional to the storage time, and the change in coloration observed is related to the formation of ice crystals. In the future new experiments must be performed in order to evaluate thawing solutions, new protocols for MEV and to test the viability of embryos and larvae of this species for cryopreservation.

Biblioteca responsável: BR68.1