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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216270

Resumo

O lentivírus caprino apresenta-se disseminado no Brasil, propiciando a ocorrência de infecções secundárias, as quais são comuns em animais com enfermidade viral. Ademais, infecções por Mycoplasma agalactiae (M. agalactiae) são diagnosticadas em muitos estados nordestinos, os quais também se encontra presente o vírus da artrite encefalite caprina (CAEV), onde a inexistência de vacina ou tratamento eficaz propicia a eliminação de muitos reprodutores de alta qualidade genética dos rebanhos. Nesse contexto, há a necessidade de buscar métodos de evitar a disseminação do vírus pela via reprodutiva, e consequentemente evitar o estabelecimento de infecções simultâneas. Assim, objetivou-se determinar a ocorrência de coinfecção pelo lentivírus caprino e Mycoplasma agalactiae nos rebanhos leiteiros do Ceará, bem como avaliar in vitro a atividade antiviral de extratos etanólicos de Azadirachta indica A. Juss. (nim) contra esse lentivírus presente no sêmen caprino. Esse trabalho foi dividido em três etapas. Na 1ª etapa investigou-se a existência de anticorpos anti-Mycoplasma agalactiae em rebanhos leiteiros no estado do Ceará e a sua possível correlação com a artrite encefalite caprina (CAE). Utilizaram-se 417 fêmeas e 69 reprodutores caprinos (486 animais) de raças com aptidão leiteira, puros ou mestiços, de sistema intensivo ou semi-intensivo, advindos de quatro mesorregiões do estado do Ceará. Anticorpos contra o CAEV foram detectados pela microtécnica de imunodifusão em gel de ágar (IDGA) e de Western Blot (WB). Já os anticorpos anti-Mycoplasma agalactiae optou-se pelo kit comercial de imunoensaio enzimático da IDEXX Laboratories. A soroprevalência de M. agalactiae em rebanhos de caprinos leiteiros no Ceará foi de 0,62% (3/486). Não evidenciou correlação entre os resultados obtidos no ELISA para M. agalactiae e CAEV por IDGA ou por WB (p<0,05). Na 2ª etapa, buscou-se determinar a concentração ideal de dimetilsulfóxido (DMSO) a ser usado na dissolução dos extratos etanólicos. Pool de sêmen de cinco caprinos foi diluído em meio essencial mínimo (MEM) enriquecido com glicose a 0,01M, acrescido de concentrações de DMSO (0; 1,5; 1,75; 2,0; 2,25 e 2,5%). Os tratamentos foram refrigerados a 7°C e avaliados até quatro horas após adição de DMSO. Mensurou-se motilidade individual progressiva (MIP), vigor espermático (V), porcentagem de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico (HO) e morfologicamente normais (NOR). MIP, vigor e NOR permaneceram dentro dos padrões normais para caprinos em todos os tratamentos. Com isso não foi evidenciado interferência do DMSO nos parâmetros analisados, quando adicionado a uma concentração máxima de 2,5% ao diluidor MEM, sem interferir na qualidade do sêmen caprino refrigerado. Por fim na 3ª etapa, avaliou-se o efeito dos extratos etanólicos de Azadirachta indica ao sêmen caprino, e seu potencial de inativar o CAEV no mesmo. Para tanto, pool de sêmen de quatro reprodutores caprinos foi diluído em MEM enriquecido com glicose a 0,01M e das frações testes (extrato bruto, acetato de etila e etanol) previamente dissolvidas em DMSO em duas concentrações (75g/mL e 150g/mL) e seus parâmetros espermáticos (MIP, V, NOR) avaliados a cada duas horas pós-adição dos extratos até um período máximo de quatro horas. Em seguida, um novo pool de sêmen foi infectado com cepa CAEV Cork e tratado com as respectivas frações testes (extrato bruto, acetato de etila e etanol) por 30, 60 e 90 minutos, em duas concentrações (75g/mL e 150g/mL) para então ser cocultivado com células de membrana nictitante ovina (MNO) durante 63 dias, com realização de Nested PCR do DNA pró-viral do sobrenadante coletado a cada sete dias e da respectiva passagem celular, e RT-nPCR do sobrenadante coletado na semana seguinte pós-passagem. Todos os parâmetros espermáticos permaneceram dentro da normalidade para espécie caprina em todos os tratamentos, e sem apresentar diferença estatística (p>0,05) entre os mesmos. O extrato Azadirachta indica em Acetato de Etila e Etanol na concentração de 150g/mL teve ação antiviral contra o lentivírus, no entanto, novos ensaios devem ser realizados para poder validá-lo. Como conclusão geral, essa pesquisa demonstrou que não foi verificada a existência de correlação positiva na incidência de infecção pelo CAEV e pelo M. agalactiae no presente estudo no estado do Ceará, e que em virtude da disseminação da CAE pelo estado que os extratos etanólicos de Azadirachta indica dependendo da concentração e fração, há potencial de inibir o lentivírus caprino no sêmen, podendo ser uma ferramenta válida no controle do vírus pela via reprodutiva.

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The caprine lentivirus is disseminated throughout Brazil causing the occurrence of secondary infections, which are common in animals with viral disease. In addition, infections by Mycoplasma agalactiae (M. agalactiae) are frequently diagnosed in several states of the Northeastern region of Brazil, in which the caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) is also found very often. In these locations, the lack of vaccine or effective treatment forces the elimination of many breeders that have elevated genetic value from the flocks. In this context, there is a necessity of seeking methods to avoid virus transmission through reproduction and consequently prevent simultaneous infections. Hence, this study aimed to determine the occurrence of coinfection by the caprine lentivirus and Mycoplasma agalactiae in dairy flocks of Ceará. In addition, the antiviral activity of ethanol extracts of Azadirachta indica A. Juss. (nim) against this lentivirus was evaluated in the caprine semen. This study was divided in three steps. First, the presence of anti-Mycoplasma agalactiae antibodies was assessed in dairy flocks in Ceará state and the possible correlation between these cases and the caprine arthritis encephalitis (CAE). A total of 417 female and 69 male caprine breeders (486 animals) with milk production aptitude were used in this study. These animals were pure or mix breed and reared in intensive or semi-intensive systems distributed in four mesoregions of Ceará state. CAEV antibodies were detected with micro technique of agar gel immunodiffusion (AGID) and Western Blot (WB). The presence of anti-Mycoplasma agalactiae antibodies was assessed with an enzymatic commercial kit of IDEXX Laboratories. Seroprevalence of M. agalactiae in dairy caprine flocks in Ceará was 0.62% (3/486). There was no correlation between the results obtained from ELISA to M. agalactiae and CAEV using AGID or WB (p<0.05). In the second part of the study, the ideal concentration of dimethyl sulfoxide (DMSO) to be used in the dissolution of the ethanol extracts. Pooled samples of the semen obtained from five goats were diluted in minimal essential medium (MEM) enriched with glucose at 0.01M added different DMSO concentrations (0; 1.5; 1.75; 2.0; 2.25 and 2.5%). Treatments were refrigerated at 7°C and evaluated up until four hours after the addition of DMSO. Individual progressive motility (IPM), spermatic vigor (V), percentage of spermatozoids reactive to hyposmotic test (HO) and normal morphology (NOR) were evaluated. IPM, V and NOR values were within normal levels expected for the caprine species in all treatments. Hence, there was no effect of DMSO used to perform MEM dilution in the analyzed parameters of caprine refrigerated semen even in the maximum concentration of 2.5%. In the final part of the study, the effects of ethanol extracts of Azadirachta indica in the caprine semen and the potential to inactivate the CAEV were evaluated. Pooled semen samples of four goats were diluted in MEM enriched with glucose at 0.01M and fractions to be tested (brute extract, ethyl acetate and ethanol) previously dissolved in DMSO in two concentrations (75g/mL and 150g/Ml). Sperm quality parameters (IPM, V and NOR) were evaluated every two hours after the addition of extracts until the maximum period of four hours. Then, a new pool of semen was infected with CAEV Cork strain and treated with the respective fraction tests (brute extract, ethyl acetate and ethanol) for 30, 60 and 90 minutes in two concentrations (75g/mL and 150g/mL). Then, samples were co-cultured with ovine nictitating membrane cells (NMC) for 63 days, during which nested-PCR was performed to identify pro viral DNA in supernatant collected every seven days and in the respective cellular passage, and RT-nPCR in the supernatant collected a week after the passage. All sperm parameters remained within normal standards for the caprine species in all treatments and with no statistic difference between them (p>0.05). The ethyl acetate and ethanol extracts of Azadirachta indica in the concentration of 150g/mL presented antiviral effect against the lentivirus. However, new studies must be performed to validate these results. As a general conclusion, this study demonstrated that there is no positive correlation between the incidence of CAEV and M. agalactiae in Ceará state. In addition, considering the dissemination of CAE in this state, the ethanol extracts of Azadirachta indica, depending on the fraction and concentration, may present a potential inhibition effect against the caprine lentivirus in semen, which may be a valid tool for controlling the virus in reproduction.

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