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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216283

Resumo

O presente estudo teve como objetivo elucidar o envolvimento das Prostaglandinas (PGs) E2 e F2 na maturação in vitro (MIV) de ovócitos bovinos. Nos primeiros experimentos, avaliou-se a cinética de maturação nuclear e o perfil de expressão de genes envolvidos na atividade dessas PGs (PTGS2, PTGES1, PTGER2 e AKR1B1) nas células do cumulus (CCs) de ovócitos bovinos de diferentes competências, antes a após a maturação. Os complexos cumulus-ovócitos (CCOs) foram obtidos de folículos dissecados de 1,0-2,9 mm (ovócitos incompetentes; INC) e 6,0-8,0 mm (ovócitos competentes; COM), e o grupo controle, da aspiração folicular de folículos de 3-8 mm (CTL). Para a cinética os CCOs foram desnudados, fixados, corados com lacmoide e avaliados quanto ao estágio de maturação nuclear. Já para a determinação do nível de transcritos os CCOs foram desnudados e as CCs coletadas para a análise por RT-qPCR. No terceiro experimento, o efeito da suplementação do meio de maturação com PGE2 e PGF2 foi avaliado. Os CCOs, aspirados de folículos de 3-8mm foram selecionados e distribuídos em cinco tratamentos: T1 (meio de maturação; CTL); T2 (meio de maturação suplementado com 10M de NS398 -inibidor específico da PTGS2); T3 (meio de maturação suplementado com 1M de PGE2 e 10M NS398); T4 (meio de maturação suplementado com 1M de PGF2 e 10M NS398); T5 (meio de maturação suplementado com 1M de PGE2, 1M PGF2 e 10M NS398). Após 24 horas de MIV, os CCOs foram avaliados quanto ao grau de expansão das CCs e, posteriormente, foram fecundados e cultivados in vitro até o D7 de desenvolvimento. Avaliou-se as taxas de clivagem em D2 e de blastocistos em D6 e D7. Os blastocistos de D7 foram avaliados quanto ao número total de células e a porcentagem de células com fragmentação do DNA. Os dados de taxa de maturação e desenvolvimento embrionário foram analisados pelo teste do Qui-quadrado, os de padrão de expressão gênica por análise de variância e teste de Tukey, e para a fragmentação do DNA (TUNEL), foi utilizado o teste de Tukey. Os resultados mostraram que ovócitos de diferentes competências apresentaram cinética de maturação nuclear semelhante (P>0,05). Durante a MIV a abundância relativa do RNAm para o gene PTGS2 nas CCs aumentou (P<0,05) no grupo INC, enquanto a de PTGES1 aumentou (P<0,05) nos grupos INC e COM. O nível de transcritos de AKR1B1 diminuiu (P<0,05) no grupo INC e o de PTGER2 não variou (P>0,05). Quando comparados no mesmo momento de maturação, o nível de transcritos de todos os genes avaliados foi semelhante (P>0,05) entre os grupos, tanto às 0 quanto as 24 horas de MIV. Com exceção do gene PTGS2 que apresentou menor expressão às 24 horas no grupo COM do que os grupos INC e CTL. Os tratamentos não afetaram (P>0,05) a expansão das CCs, a taxa de clivagem nem a qualidade embrionária, mas promoveram uma diminuição (P<0,05) nas taxa de blastocistos dos grupos tratados com PGs. Com base nos resultados conclui-se que apesar da suplementação do meio de maturação com PGE2 e PGF2 ter efeito prejudicial no desenvolvimento embrionário, os genes relacionados à atividade dessas PGs são diferencialmente expressos durante a maturação, e o gene PTGS2 se mostrou um bom marcador da competência dos CCOs maturos.

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The present study aimed to elucidate the involvement of Prostaglandins E2 and F2 on the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes. In the first experiments, we evaluated the kinetics of nuclear maturation and the expression profile of genes involved in the activity of these PGs (PTGS2, PTGES1, PTGER2 and AKR1B1) in cumulus cells (CCs) of bovine oocytes of different competences, before and after maturation. The cumulus-oocyte complexes (CCOs) were obtained from dissected follicles of 1.0-2.9 mm (incompetent oocytes; INC) and 6.0-8.0 mm (competent oocytes; COM), and from aspirated 3-8 mm diameter follicles as the control (CTL). For the kinetics, CCOs were denuded, fixed, stained with lacmoid and evaluated for meiotic stage. For the determination of the level of transcripts CCOs were denuded and CCs collected for the analysis by RT-qPCR. In the third experiment, the effect of the supplementation of maturation medium with PGE2 and PGF2 was evaluated. The CCOs aspirated from 3-8mm follicles were selected and distributed into five treatments: T1 (maturation medium; CTL); T2 (maturation medium supplemented with 10M of NS398 - PTGS2 specific inhibitor); T3 (maturation medium supplemented with 1M PGE2 and 10M NS398); T4 (maturation medium supplemented with 1M of PGF2 and 10M NS398); T5 (maturation medium supplemented with 1M PGE2, 1M PGF2 and 10M NS398). After 24 hours of IVM, CCOs were evaluated for CCs expansion and were subsequently fertilized and cultured in vitro up D7 of development. Cleavage and blastocyst rate at D6 and D7, total cells number and percentage of cells with DNA fragmentation were evaluated. Maturation and embryonic development data were analyzed by Chi-square test, gene expression by analysis of variance and Tukey's test and DNA fragmentation by Tukey's test. The results showed that oocytes of different competences presented similar nuclear maturation kinetics (P> 0.05). The relative abundance of PTGS2 gene in the CCs increased (P <0,05) during IVM in INC group, while that of PTGES1 increased (P <0.05) in INC and COM groups. Level of AKR1B1 transcripts was lower (P <0.05) in the INC group than in the other groups and that of PTGER2 did not change among them (P> 0.05). When gene expression was compared among groups at the same time of maturation, transcript levels of all genes evaluated were similar (P> 0.05) between the groups, at both 0 and 24 hours of IVM, exception for PTGS2 gene that presented lower expression at 24 hours in the COM group than in the INC and CTL groups. Treatments did not affect the expansion of CCs, cleavage rate nor the embryonic quality (P> 0.05), but promoted a decrease (P <0.05) in the blastocyst rates on the PGs treated groups. Based on the results it can be concluded that although the supplementation of the maturation medium with PGE2 and PGF2 has detrimental effect on the embryonic development, genes related to the activity of these PGs are differentially expressed during maturation. In addition, PTGS2 gene showed to be a good marker for competence of mature CCOs

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