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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216354

Resumo

A mastite é a principal doença que interfere na produção leiteira de ruminantes trazendo prejuízos econômicos ao produtor. O micro-organismo mais prevalente no rebanho é Staphylococcus aureus e no grupo dos coliformes destaca-se Escherichia coli, causadora frequente de mastite clínica. O tratamento, que é um dos principais desafios para o combate à doença, ocorre através da aplicação de antibióticos, que devido ao seu uso indiscriminado pode favorecer o aumento da resistência antimicrobiana e a formação de biofilmes, além de contribuir para o desenvolvimento de infecções crônicas e recidivas da doença. Dessa forma o uso de antibióticos deve ser realizado de forma criteriosa e a busca por compostos naturais, tem aumentado cada vez mais podendo contribuir para o combate de doenças causadas por micro-organismos. O objetivo do presente trabalho foi classificar a produção de biofilmes e verificar se o uso dos medicamentos enrofloxacina e gentamicina, e da benzofenona 2,24triidroxibenzofenona e o complexo 7-epiclusianona-cobre (7-epi-cu) interferem na produção e na erradicação de biofilmes produzidos por Staphylococcus aureus e Escherichia coli isolados de mastite clínica, subclínica e recidivante de caprinos. Foram utilizados no estudo 34 isolados, sendo 26 de S. aureus e oito de E. coli que foram classificados quanto à produção de biofilmes em fracos, moderados ou forte produtores, através da inoculação em microplaca de poliestireno de 96 poços medindo-se a absorvância em leitor de Elisa onde os valores de densidade óptica (D.O) e a média aritmética das duplicatas foram calculadas. Os isolados foram submetidos ao teste de concentração inibitória mínima (MIC) além de seis concentrações subinibitórias (1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,06; 0,03×MIC) para verificar se essas concentrações induziriam a formação de biofilmes. A erradicação de biofilmes foi avaliada através de 1xMIC e 0,5xMIC por comparação com os controles. Os testes de Kolmogorov-Smirnov e de Bartlett foram utilizados para avaliar a normalidade dos erros e a homogeneidade de variâncias das médias calculadas. A comparação entre as médias foi realizada pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. O programa estatístico utilizado foi o Statistical Analysis System (SAS). Entre os isolados de S. aureus obtidos de mastite clínica, 83,3% (5/6) foram fortes produtores de biofilmes e 16,6% (1/6) moderados produtores. Quanto aos isolados de mastite subclínica 50% (6/12) foram fortes produtores de biofilmes, 33,3% (4/12) moderados e 16,6% (2/12) fracos produtores. Para a mastite recidivante, 12,5% (1/8) foram considerados fortes produtores, enquanto 87,5% (7/8) considerados moderados produtores de biofilme. Os maiores valores de MICs encontrados foram superiores a 250 µg/mL. Os menores valores de MIC foram observados para o antibiótico gentamicina. Para a enrofloxacina e o complexo 7-epi-cu, os valores de MIC variaram de 3,9 a 125 µg/mL. Para os isolados de E. coli, nenhum apresentou-se como forte produtor de biofilmes. Os isolados de mastite clínica 66,7% (2/3) foram moderados produtores de biofilme e 33,3% (1/3), fraco produtor. Entre os E. coli isolados de mastite subclínica, 75% (3/4) foram moderados produtores, enquanto 25% (1/4) foi fraco produtor. Os isolados de E. coli apresentaram comportamento semelhante das MICs dos antibióticos e do complexo 7-epi-cu aos isolados de S. aureus. Os resultados demonstraram que independente do tipo de mastite, os antibióticos enrofloxacina e gentamicina, assim como o complexo 7-epi-cu, induziram a formação de biofilmes nas seis concentrações subinibitórias avaliadas e não erradicarem os biofilmes em 1×MIC e 0,5×MIC. Embora gentamicina e 7 epi-cu tenham apresentado valores de MIC satisfatórios não foi possível eliminar os biofilmes formados pelos isolados, sendo necessário mais estudos, principalmente em isolados caprinos, para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos com a persistência da mastite principalmente ligada aos biofilmes.

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Mastitis is the main disease that interferes with the milk production of a herd bringing economic losses to the producer. The most prevalent microorganism in the herd is Staphylococcus aureus and in the group of coliforms, Escherichia coli is a frequent cause of clinical mastitis. The treatment, which is one of the main challenges for the fight against the disease, occurs through the application of antibiotics that due to its indiscriminate use can favor the increase of antimicrobial resistance and the formation of biofilms, besides contributing to the development of chronic infections and recurrence of pathology. Thus, the use of antimicrobials must be performed in a careful way and the search for natural compounds, such as benzophenones, has been increasing and may contribute to the control of mastitis in the herd. The objective of the present study was to classify the production of biofilms and to verify if the use of enrofloxacin and gentamicin, and benzophenone 2,2'4-trihydroxybenzophenone and 7-epiclusianone-copper complex (7-epi-cu) interfere in the production and in the eradication of biofilms produced by Staphylococcus aureus and Escherichia coli isolated from clinical, subclinical and recurrent mastitis of goats. A total of 34 isolates were used in the study, of which 26 S. aureus and eight E. coli were classified as poor, moderate or strong biofilm producer by inoculation in a 96-well polystyrene microplate, by measuring the absorbance in ELISA reader where the optical density (OD) and arithmetic mean values were calculated. Subsequently, the isolates were submitted to the minimum inhibitory concentration (MIC) test for each antimicrobial and benzophenone. In addition, six subinhibitory concentrations (1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.06, 0.03×MIC) were used to verify if these concentrations would induce the biofilm formation. Biofilm eradication was assessed through the MIC and 0.5×MIC by comparison with controls. The Kolmogorov-Smirnov and Bartlett tests were used to evaluate the normality of the errors and the homogeneity of variances of the means. The comparison between the means was performed by the Tukey test at 5% of probability. The statistical program used was the Statistical Analysis System (SAS). Among isolates of S. aureus obtained from clinical mastitis, 83.3% (5/6) were strong biofilm producers and 16.6% (1/6) moderate producers. Concerning the isolates of subclinical mastitis, 50% (6/12) were strong producers of biofilms, 33.3% (4/12) moderate and 16.6% (2/12) weak producers. For recurrent mastitis, 12.5% (1/8) were considered as strong producers, while 87.5% (7/8) considered moderate biofilm producers. Most isolates had MICs higher than 250 g/mL. The lowest MIC values were observed for the antimicrobial gentamicin. For enrofloxacin and benzophenone 7-epi-cu, MIC values ranged from 3.9 to 125 g/mL. For the E. coli isolates, none presented as a strong producer of biofilms. Isolates of clinical mastitis 66.7% (2/3) were moderate producers of biofilm and 33.3% (1/3) weak producer. Among E. coli isolates from subclinical mastitis, 75% (3/4) were moderate producers, while 25% (1/4) was weak producer. E. coli isolates showed similar behavior of antimicrobial and benzophenone MICs to S. aureus isolates. The results showed that regardless of the type of mastitis, the antimicrobials enrofloxacin and gentamicin as well as the benzophenone 7-epi-cu induced the formation of biofilms in the six subinhibitory concentrations evaluated and did not eradicate the biofilms in 1×MIC and 0,5×MIC. Although gentamicin and 7 epi-cu had satisfactory MIC values, it was not possible to eliminate the biofilms formed by the isolates, and further studies, mainly in goat isolates, are needed to better understand the mechanisms involved in the persistence of mastitis mainly related to biofilms.

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