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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216453

Resumo

Com o objetivo de aumentar o ganho genético e melhorar a qualidade do rebanho brasileiro, faz-se necessário o uso de biotécnicas da reprodução. Cerca de 99,9% dos folículos que compõe a reserva folicular ovariana não chegam ao seu estágio de maturação final, estes sofrem um processo denominado atresia, havendo grande perda folicular. Com o objetivo de garantir um melhor aproveitamento dos folículos pré-antrais, o cultivo in vitro destes folículos permite seu desenvolvimento, crescimento e possivelmente seu posterior uso. Uma vez otimizado, esta técnica permitie a obtenção da ovulação in vitro, além da produção de embriões a partir desses oócitos ovulados. O meio de cultivo tem grande influencia na ativação e desenvolvimento folicular, assim como o sistema de cultivo aplicado. O hormônio folículo estimulante (FSH) tem papel importante no crescimento e maturação folicular, agindo nas células da granulosa dos folículos que compõe a reserva folicular. Assim como o sistema bidimensional, promove um ambiente semelhante ao ovário, mimetizando sua arquitetura. Dessa forma, o objetivo do presente estudo, ao combinar um sistema de cultivo bidimensional e a suplementação com FSH, haja um desenvolvimento folicular superior ao material cultivado em apenas meio base. Foram utilizados ovários de vacas cíclicas (n= 6), retirados os tecidos circundantes e os ligamentos, e separados os pares de cada animal. Em seguida, foram feitos fragmentos de 3X3X3 mm no córtex ovariano. Para cada par de ovário, foi selecionado um fragmento aleatório e imediatamente foi fixado em Bouin representando assim, o grupo controle não cultivado, D0. Os fragmentos restantes (n= 8 fragmentos, de cada animal) foram transportados até o laboratório e cultivados individualmente nos diferentes tratamentos em alíquotas de 1 mL de meio de cultivo em placas de cultivo de 24 poços em estufa a 38,5ºC, numa atmosfera de 5 % de CO2 em ar e umidade saturada. O meio de cultivo controle constituiu de MEM, 0,23 mM de piruvato, 2 mM glutamina, 2 mM hipoxantina, 1,25 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA Gibco BRL, Rockville, MD, USA), 20 UI/mL de penicilina e 200 mg/mL de estreptomicina. Para os tratamentos, o meio MEM+ foi suplementado com diferentes concentrações (50, 100 ou 200 ng/mL) de FSH (Folltropin®, Bioniche Canadá Inc, Ontário, Canadá). Oito fragmentos, do córtex ovariano de cada animal, foram cultivados nos meios testado por seis (D6) ou doze (D12) dias. A cada intervalo de dois dias, o meio de cultivo foi substituído por meio fresco. Os folículos pré-antrais foram classificados de acordo com o estágio de desenvolvimento (primordial, primário, secundário) e quanto à morfologia (normal ou degenerado). Os dados analisados foram submetidos à ANOVA e teste de Tukey (p0,05). No estudo realizado, foi possível observar uma diferença significativa na proporção de folículos ovarianos primordiais e em desenvolvimento, sugerindo assim a provável ocorrência de uma ativação destes folículos cultivados in vitro. A concentração que melhor apresenta condições para o desenvolvimento folicular e garantiu a manutenção da integridade folicular foi 50 g/ml de FSH em 12 dias de cultivo.

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With the objective of increasing the genetic gain and improving the quality of the Brazilian herd, it is necessary to use biotechniques of the reproduction. Approximately 99.9% of the factories that make up the ovarian follicular reserve not reaching their final stage of maturation, they undergo a process called atresia, with great follicular loss. In order to guarantee a better utilization of the preantral follicles, the in vitro culture of these follicles allows its development, growth and possibly its later use. Once optimized, this technique allows in vitro ovulation to be obtained, in addition to the production of embryos from ovulated oocytes. The culture medium has great influence on follicular activation and development, as the culture system applied. The follicle stimulating hormone (FSH) plays an important role in follicular growth and maturation, acting on the granulosa cells of the plants that make up a follicular reserve. Just like the two-dimensional system, you promote an environment at your fingertips, mimicking your architecture. Thus, the objective of the present study, when combining a two-dimensional culture system and FSH supplementation, has a higher follicular development than the material grown in only the base medium. Ovaries from cyclic cows (n = 6) were used, the surrounding tissues and ligaments were removed, and pairs separated from each animal. In., Fragments of 3X3X3 mm were made in the ovarian cortex. For each ovary pair, a random fragment was selected and related to Bouin, thus representing the uncultured control group, D0. The remaining fragments (n = 8 fragments, from each animal) were transported to the laboratory and individually cultured in the different treatments in 1 ml aliquots of culture medium in 24-well culture plates in an oven at 38.5 ° C in an atmosphere of 5% CO2 in air and saturated humidity. The control culture medium comprised of MEM, 0.23 mM pyruvate, 2 mM glutamine, 2 mM hypoxanthine, 1.25 mg / mL bovine serum albumin (BSA Gibco BRL, Rockville, MD, USA), 20 IU / ml penicillin and 200 mg / ml streptomycin. For the treatments, the MEM + medium was supplemented with different concentrations (50, 100 or 200 ng / mL) of FSH (Folltropin®, Bioniche Canada Inc, Ontario, Canada). Eight fragments of the ovarian cortex of each animal were cultured on media tested for six (D6) or twelve (D12) days. At each interval of two days, the culture medium was replaced with fresh medium. Primates, primary, secondary and morphology (normal or degenerate). The analyzed data were submitted to ANOVA and Tukey test (p0.05). No study was carried out, it was seen in a very important way in the proportion of primordial and developing ovarian leaflets, thus suggesting a probable occurrence of an activation of these leaflets grown in vitro. The concentration that best presents conditions for the follicular development and guaranteed the maintenance of the follicular integrity to 50 g / ml of FSH in 12 days of culture

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