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ASSOCIAÇÃO DE CRIOPROTETORES PERMEÁVEIS E NÃO PERMEÁVEIS PARA A CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS DE TECIDO ADIPOSO EQUINO

CATIA NASCIMENTO.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216561

Resumo

O uso de células tronco mesenquimais (CTMs) tem sido vastamente investigado para o tratamento de doenças musculoesqueléticas em equinos, principalmente, devido às injúrias sofridas durante a atividade física intensa. É conhecido também que para o sucesso do procedimento, é necessária uma grande quantidade de CTMs viáveis, o que pode ser obtido através de um banco de células. Portanto, a criopreservação é um tema de grande interesse na área da terapia celular, pois pode manter a viabilidade de um material biológico por longos períodos de tempo. No entanto, o uso de agentes crioprotetores (CPAs) permeáveis, como o DMSO, nos processos de criopreservação (congelação lenta ou vitrificação) pode causar injúrias, devido sua toxicidade, o que pode ser minimizado, quando usados em baixas concentrações ou associados a ACPs não permeáveis, como os açúcares ou os polímeros sintéticos. Portanto, o objetivo principal deste estudo foi avaliar a viabilidade, capacidade proliferativa e de diferenciação (linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica) das CTMs equinas oriundas do tecido adiposo após a congelação na presença de diferentes soluções compostas por ACPs, permeável (DMSO) e não permeáveis [(Trealose (T) e SuperCool X-1000 (X-1000)]. A combinação desses ACPs, resultou em sete diferentes soluções de congelação (SC): DMSO; T; X-1000; DMSO+T; DMSO+X-1000; T+X-1000 e DMSO+T+X-1000. Inicialmente, as CTMs equinas frescas (controle) ou congeladas nas diferentes SC foram avaliadas quanto à viabilidade. Posteriormente, a unidade formadora de colônia (CFU - proliferação) e a capacidade de diferenciação celular nas linhagens acima mencionadas foram avaliadas, somente nas células frescas ou que apresentaram viabilidade superior a 40%, após congelação/descongelação. Os dados mostraram que a viabilidade pós congelação das CTMs equinas em todas as SC, reduziu significativamente em relação ao controle (100%). No entanto, a viabilidade das CTMs congeladas na presença apenas do DMSO (80.3 ± 0.6) foi superior (P<0.05) à observada nas demais SC. Para a CFU, não houve diferença (P>0.05) entre as células frescas e as congeladas. Independente do tratamento, as CTMs apresentaram potencial de diferenciação nas três linhagens. Porém, apesar da redução significativa na capacidade de diferenciação osteogênica, não houve diferença (P>0.05) entre as SC testadas e o controle. Por outro lado, células congeladas em DMSO+X-1000 reduziram (P<0.05) seu potencial de diferenciação na linhagem condrogênica em relação ao controle, porém, foi semelhante às demais SC (P>0.05). No tocante à diferenciação adipogênica, não houve diferença entre os tratamentos (P>0.05). Em conclusão, esse estudo confirmou o sucesso da congelação de CTMs na presença do DMSO e evidenciou o potencial de utilização do polímero sintético Super Cool X-1000 na congelação de células tronco, abrindo novas perspectivas para investigação do uso desse polímero e o DMSO em diferentes concentrações e combinações.
The mesenchymal stem cells (MSCs) have been widely investigated for the treatment of musculoskeletal diseases in horses mainly due to the injuries suffered during the intensive physical activity. Likewise, it is well known that for the success of the procedure is necessary a great quantity of viable MSCs, which can be obtained through a cell banking. Therefore, the cryopreservation is a theme of high interest in the cellular therapy area once it can maintain the viability of biological material for long periods of time. However, the use of permeable cryoprotectant agents (CPAs), such as DMSO can cause injuries due to its toxicity, which can be minimized when used in low concentrations or association with non-permeable cryoprotectants, such as sugars or the synthetic polymers. Therefore, the goal of this study was to evaluate the viability, proliferative capacity and the differentiation of the equine MSCs originated from the adipose tissue after freezing in the presence of different solutions comprised by permeable (DMSO) and non- permeable [(Trehalose (T), and SuperCool X-1000 (X-1000)] CPAs. The combination of these CPAs resulted in seven different freezing solutions (FS): DMSO; T; X-1000; DMSO+T; DMSO+X-1000; T+X-1000, and DMSO+T+X-1000. Firstly, fresh or frozen/thawed equine MSCs in the different FS were evaluated concerning viability. After that, the colony forming unit (CFU - proliferation) and the cellular differentiation capacity in the abovementioned lineages were evaluated only in fresh cells or that showed viability superior to 40% after frozen/thawing. The data demonstrated that the viability after freezing of the equine MSCs reduced significantly (100%) to the control. Nonetheless, the viability of the frozen MSCs in the presence only of DMSO (80.3 ± 0.6) was superior (P<0.05) to the others FS. Regarding CFU, no difference (P>0.05) was observed between fresh and frozen cells. Independently of the treatment, the MSCs demonstrated differentiation potential in the three lineages. Nevertheless, despite the significate reduction in the osteogenic differentiation capacity, no differences (P>0.05) among the tested FS and the control. By the other hand, frozen cells in DMSO+X solution reduced (P<0.05) the differentiation potential for the chondrogenic lineages to the control, but similarly to the other FS (P>0.05). Concerning the adipogenic differentiation, no difference was observed between the treatments (P>0.05). In conclusion, this study confirmed the success of the freezing of MSCs in the presence of DMSO, and emphasized the potential utilization of the synthetic polymer Super Cool X-1000 in the freezing of stem cells, opening new perspectives for the investigation of X-1000 and DMSO in different concentrations and combinations.
Biblioteca responsável: BR68.1