EFEITO IN VITRO DO FLUIDO E CÉLULAS EPITELIAIS DO OVIDUTO BOVINO NA FASE FOLICULAR OU LUTEAL NA FUNÇÃO E CAPACITAÇÃO DE ESPERMATOZOIDES OVINOS

RESUMO

O fluido do oviduto (FO) desempenha importante função na capacitação espermática e fertilização. Ainda, as células epiteliais do oviduto (CEO) interagem com o espermatozoide (SPZ) prolongando a sua vida útil. Evidências na literatura sugerem que o FO varia de acordo com a fase do ciclo estral, no entanto, pouco se sabe sobre os efeitos dessa variação na função espermática. Assim, o objetivo do estudo foi avaliar o efeito do FO da fase folicular e luteal e a interação do SPZ com CEO na modulação da função espermática e dos processos de capacitação/reação acrossômica (RA). Para alcançar esse objetivo, dois experimentos foram realizados. Para isso, FO na fase folicular e luteal (classificação baseada na morfologia ovariana) e CEO foram obtidas de ovidutos de vacas oriundas de matadouro. Para ambos os experimentos, após a técnica de swim-up (pool de três carneiros), os SPZ foram distribuídos aleatoriamente nos grupos experimentais. No experimento 1, 8 x 106 SPZ/mL foram adicionados ao meio i) Fert-TALP (controle positivo), ii) Fert-TALP sem indutores da capacitação espermática (Fert-TALP modificado; controle negativo), iii) Fert-TALP modificado, suplementado com 10% de FO da fase folicular ou iv) FertTALP modificado, suplementado com 10% de FO na fase luteal. No experimento 2, para mimetizar as condições do oviduto durante a fase folicular e luteal, as CEO foram cultivadas no meio TCM-199, suplementada com 10% de soro fetal bovino até a confluência. Previamente (24 h) ao cocultivo com SPZ, foi realizada a indução das condições luteal e folicular pela suplementação dos hormônios 17 -estradiol (E2) e progesterona (P4) no meio nas concentrações detectadas no oviduto durante estas fases. Para o cocultivo, 8 x 106 SPZ/mL foram adicionados na presença da monocamada de CEO i) CEO fase folicular cocultivo de SPZ e CEO no meio FertTALP, com suplementação de 290 pg/mL E2 e 6 ng/mL P4 (concentração similar a fase folicular); ii) CEO fase luteal cocultivo de SPZ e CEO no meio Fert-TALP, com suplementação de 80 pg/mL E2 e 85 ng/mL P4 (concentração similar a fase luteal); iii) cultivo de SPZ no meio Fert-TALP, com suplementação de 290 pg/mL de E2 e 6 ng/mL P4 e iv) cultivo de SPZ no meio Fert-TALP, com suplementação de 80 pg/mL E2 e 85 ng/mL P4. Para o grupo controle positivo, foi utilizado o meio Fert-TALP convencional. Os SPZ foram incubados a 38 °C em 5% de CO2 e os parâmetros da cinemática espermática, integridade da membrana plasmática (MP) e status da capacitação espermática foram avaliados após 0, 2, 4, 6 e 18 e 24 h. As variáveis foram submetidas ao teste two-way ANOVA com medidas repetidas (Bonferroni; P < 0,05). Os resultados do Experimento 1, mostraram que a incubação de até 4 h com FO independente do estágio do ciclo estral promoveu aumento na maioria dos parâmetros da cinemática espermática de forma similar (P 0,05) ao grupo controle positivo, enquanto que no Experimento 2, esses parâmetros foram reduzidos (P < 0,05) pelo co-cultivo entre SPZ e CEO, independente do estágio do ciclo estral. A integridade da MP não foi afetada (P 0,05) pela incubação com FO e CEO na fase folicular ou luteal. Incubação com FO independente do estágio do ciclo estral apresentou maior (P < 0,05) taxa de RA em comparação ao grupo controle negativo após longo tempo de incubação (18-24 h) enquanto que a interação das CEO (folicular ou luteal) reduziu (P < 0,05) a taxa de capacitação espermática em comparação ao grupo controle positivo ao longo da incubação. Conclui-se que utilizando a espécie ovina como modelo, a adição do FO na fase folicular ou luteal promove um aumento na cinemática espermática até 4 h de incubação e na taxa de RA após 18-24 h, enquanto que a interação das CEO com SPZ reduz a cinemática espermática e atrasa a capacitação espermática in vitro.

ABSTRACT

Oviduct fluid (OF) provides a suitable environment for the sperm capacitation and fertilization. Still, oviductal epithelial cell (OEC) interacts with sperm prolonging sperm lifespan. Evidences on literature suggest that OF varies according to the stage of estrous cycle, however, there are only few reports about the effect of this variation on sperm function. Thus, the objective of the study was to evaluate the effect of OF at follicular and luteal phases and the interaction of sperm with OEC on the modulation of sperm function and capacitation/acrosome react (AR) processes. To achieve this goal, two experiments were performed. For this, OF at follicular and luteal phases (classification based on ovarian morphology) and OEC were obtained from cow oviducts at a slaughterhouse. For both experiments, after swim-up technique (pool of three rams) sperm were randomly distributed in the experimental groups. In Experiment 1, 8 x 106 sperm/mL were added in the medium i) Fert-TALP (positive control), ii) Fert-TALP without capacitating substance (modified Fert-TALP; negative control), iii) modified Fert-TALP supplemented with 10% of OF at follicular phase or iv) modified Fert-TALP supplemented with 10% of OF at luteal phase. In Experiment 2, to mimic oviductal conditions during the follicular and luteal phases, the OECs were cultured in TCM-199 medium supplemented with 10% of fetal bovine serum until confluence. Previously (24 h) to co-culture with sperm, the follicular and luteal conditions were induced by supplementation of 17beta-estradiol (E2) and progesterone (P4) hormones in the Fert-TALP medium, at concentrations detected in the oviduct during these phases. For co-culture, 8 x 106 sperm/mL were added in the presence of OEC monolayer i) OEC follicular phase co-culture of sperm and OEC in Fert-TALP medium supplemented with 290 pg/mL E2 and 6 ng/mL P4 (concentration similar to follicular phase); ii) OEC luteal phase co-culture of sperm and OEC in FertTALP medium supplemented with 80 pg/mL E2 and 85 ng/mL P4 (concentration similar to luteal phase); iii) sperm culture in Fert-TALP medium supplemented with 290 pg/mL E2 and 6 ng/mL P4 and iv) sperm culture in Fert-TALP medium supplemented with 80 pg/mL E2 and 85 ng/mL P4. The positive control was the conventional Fert-TALP medium. Sperm were incubated at 38 ºC in 5% CO2 and the parameters of sperm kinematics, plasma membrane (PM) integrity and sperm capacitation status were evaluated after 0, 2, 4, 6, 18 and 24 h. The variables were subjected to a repeated measure two-way ANOVA (Bonferroni; P < 0.05). The results of the Experiment 1 showed that incubation up to four hours with OF regardless the stage of estrous cycle promoted an increase in most of kinematic parameters similar (P 0.05) to the positive control group while in Experiment 2, co-culture between sperm and OEC, regardless the stage of estrous cycle, reduced (P < 0.05) these kinematic parameters. The PM integrity was not affected (P 0.05) by incubation with OF and OEC at follicular or luteal phase. Incubation with OF regardless the phase of estrous cycle presented higher (P < 0.05) AR rate compared to the negative control group after a long-time incubation (18-24 h), while the interaction of OEC (either follicular or luteal stage) reduced (P < 0.05) sperm capacitation rate compare to positive control group throughout incubation. It is concluded that the supplementation with OF either at follicular or luteal stage into the medium, promotes an increase in the sperm kinematic for up to 4 h of incubation and AR rate after 18-24 h. In contrast, interaction between sperm and OEC reduce sperm kinematics and delay sperm capacitation in vitro using the ovine specie as a model.