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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216583

Resumo

As tripanossomoses são infecções parasitárias de homens e animais, causadas por protozoários do gênero Trypanosoma. A tripanossomose bovina (TB) é causada pelos protozoários T. vivax, T. congolense e T. brucei. Quadros agudos dessa doença são caracterizados inicialmente por hipertermia, seguida de anemia moderada a intensa, edema subcutâneo, letargia, redução na produção de leite, perda de peso progressiva, aumento de volume de linfonodos e distúrbios reprodutivos. A fase crônica ocorre quando os animais sobrevivem à fase aguda, começam a recuperar-se e tornam-se assintomáticos. O exame parasitológico direto (técnica de Woo ou esfregaços sanguíneos) é o método de diagnóstico utilizado na rotina por médicos veterinários, pois é rápido e apresenta baixo custo. Apesar disso, ambos apresentam baixa sensibilidade, impossibilitando estudos epidemiológicos eficazes, principalmente quando aplicado em animais cronicamente infectados, uma vez que apresentam baixa parasitemia e são os principais reservatórios desses protozoários. As técnicas sorológicas utilizando antígeno bruto têm sido frequentemente empregadas em estudos epidemiológicos da TB, e com base no estado imunológico dos animais é possível definir a situação epidemiológica das diferentes regiões de ocorrência dessas parasitoses. O objetivo deste trabalho foi desenvolver ferramentas de diagnósticos sorológicos mais específicos e sensíveis para a TB. Para isso, um gene conservado entre os tripanossomatídeos (MyxoTLm) foi expresso em sistema heterólogo, utilizando como vetor o plasmídeo pET28a-TEV e como sistema de expressão Escherichia coli cepa BL21 Star. A proteína heteróloga foi purificada por cromatografia de afinidade e aplicada como antígeno no teste sorológico por ELISA. Os ELISAs indiretos anti-IgM e anti-IgG, padronizados a partir do antígeno recombinante, apresentaram alto poder discriminatório quando testou-se soros de animais saudáveis (controle negativo) e com TB, atingindo especificidade de 91,30% e 95,65% e sensibilidade de 82,35% e 88,23%, respectivamente. Além disso, o antígeno demonstrou um bom desempenho para ELISA indireto anti-IgM, com área sob a curva ROC de 0,8568, e um excelente desempenho para ELISA indireto anti-IgG, com área sob a curva ROC de 0,9565. Por sua vez, o antígeno bruto usado no ELISA indireto anti-IgM atingiu sensibilidade de 70,58% e especificidade de 78,26%, e apresentou baixo desempenho no teste, com área sob a curva ROC de 0,7363. Por sua vez, para ELISA indireto com anti-IgG, o antígeno bruto atingiu sensibilidade de 82,35% e especificidade de 69,56%, e também apresentou baixo desempenho no teste, com área sob a curva ROC de 0,7570. Assim, conclui-se que a proteína recombinante 9 desenvolvida nesse estudo é promissora se aplicada ao imunodiagnóstico e demonstrou potencial para ser utilizada no diagnóstico sorológico da TB.

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Trypanosomes are parasitic infections of humans and animals, caused by protozoa of the genus Trypanosoma. Bovine trypanosomiasis (BT) is caused by the protozoa T. vivax, T. congolense and T. brucei. BT acute infections are characterized initially by hyperthermia, followed by moderate to severe anemia, subcutaneous edema, lethargy, reduced milk production, progressive weight loss, enlarged lymph nodes and reproductive disorders. The chronic phase occurs in those animals that survive the acute phase and begin to recover of infection becoming asymptomatic. Direct parasitological examination (Woo technique or blood smears) is the diagnostic method used routinely by veterinarians as it is a quick and inexpensive method. However, the low sensitivity of this technique limits its use in epidemiological studies, since chronically infected animals present low parasitemia and are considered the main reservoirs of these protozoa. Serological techniques using crude antigen have often been used in epidemiological studies of BT, and based on the immunological status of the animals it is possible to determine the epidemiological situation in different regions in which such parasitoses take place. The objective of this study was to develop more specific and sensitive serological diagnostic tools for the diagnosis of bovine trypanosomiasis. For this, a gene conserved among trypanosomatids (MyxoTLm) was expressed in a heterologous system by using pET28a-TEV plasmid as vector and Escherichia coli BL21 Star strain as expression system. The expressed protein was purified by affinity chromatography and used as antigen in an ELISA test. Indirect anti-IgM and anti-IgG ELISAs assembled with the recombinant antigen showed high discriminatory power when sera from healthy (negative control) and diseased (BT) animals were tested as they reached 91.30% and 95.65% specificity, and 82.35% and 88.23% sensitivity, respectively. In addition, recombinant protein demonstrated a good performance to detect IgM, with the area under the ROC curve of 0.8568, and excellent performance to detect IgG, with area under the ROC curve of 0.9565. The crude antigen used in the indirect anti-IgM ELISA reached 70.58% sensitivity and 78.26% specificity, and presented low test performance, with area under the ROC curve of 0.7363. When applied to the anti-IgG indirect ELISA, the crude antigen reached 82.35% sensitivity and 69.56% specificity, also presenting a low performance with area under the ROC curve of 0.7570. Therefore, the recombinant protein used in this study is promissory to be applied in the immunodiagnosis and demonstrated great potential to be utilized in BT serological diagnosis.

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