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EFEITO DA MELATONINA SOBRE O ESPERMATOZOIDE CRIOPRESERVADO DE GARANHÕES DA RAÇA CRIOULA.

CANDIDA MALDANER ROMERO TISOT.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216795

Resumo

Com o aprimoramento das biotecnologias da reprodução na equinocultura, está sendo possível obter bons resultados reprodutivos. A inseminação artificial na espécie equina pode ser realizada tanto com sêmen à fresco, resfriado ou congelado/descongelado. A preparação do ejaculado para a criopreservação envolve várias etapas desde a remoção do plasma seminal, que é a fonte predominante da proteção antioxidante espermática. Durante o congelamento e descongelamento dos espermatozoides ocorre uma diminuição no potencial de fertilização que está associado ao dano celular em decorrência do aumento na produção de espécies reativas ao oxigênio (EROs). As EROs, causam peroxidação lipídica nas membranas espermáticas e fragmentação do DNA, consequentemente afetando a viabilidade espermática. A melatonina é um potente antioxidante endógeno que auxilia na proteção do organismo contra os danos causados pelas EROs. A presença de receptores de melatonina nos espermatozoides, sugere uma possível ação sobre a função espermática, exercendo algum tipo de regulação sobre os mecanismos de defesa antioxidante. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações da melatonina sobre a motilidade, geração de EROs e a integridade das membranas acrossomal e plasmática de sêmen criopreservado de equinos da raça Crioula. Para isso, a fração rica de 3 ejaculados de 5 equinos foi diluída em diluente comercial de resfriamento com uma concentração entre 50 x 106 spz/ml. As amostras foram centrifugadas (600g x12min) e o pellet ressuspendido em diluente comercial de congelamento a uma concentração final de 200 x 106 spz/ml. A melatonina foi então adicionada ao diluente de congelamento com as células espermáticas, em diferentes concentrações (0; 1,25; 2,5 e 5 mM), sendo imediatamente realizado o envase em palhetas de 0,5 ml, que foram seladas e submetidas ao processo de criopreservação. As amostras foram descongeladas a 37ºC por 30 segundos e avaliadas quanto a motilidade em microscópio de contraste de fase e a geração de EROs e a integridade da membrana acrossomal e membrana plasmática avaliadas por citometria de fluxo com as sondas DCF-DA, FITC PNA, e PI, respectivamente. Em relação a motilidade o grupo sem melatonina e o grupo com a dose de 1,25 não apresentaram diferença (P=0.80), sendo 52,0% ± 2,42 (0) e 50,00% ± 2,18 (1,25mM). Porém o grupo com 2,5 e 5 mM apresentaram uma redução da motilidade (42,6% ± 2,28 (2,5 mM) e 33,0% ± 3,00 (5 mM)) (P<0.0004). Este mesmo padrão foi observado para o efeito da integridade de acrossoma sendo 75,48% ± 3,24 (0); 80,49% ± 1,62 (1,25 mM); 82,94% ± 1,42 (2,5 mM) e 84,90% ± 1,51 (5 mM) e de membrana plasmática 66,85% ± 3,13 (0); 66,0% ± 2,42 (1,25 mM); 70,07% ± 2,72 (2,5 mM) e 74,92% ± 1,98 (5 mM). Em relação a geração de EROs os nossos tratamentos não apresentaram diferença estatística (P>0.05). Sendo 86,5% ± 2,16 (0), 89,1% ± 1,26 (1,25mM), 89,3% ± 1,04 (2,5mM), 89,4% ± 1,03 (5mM). Conclui-se que a adição de melatonina ao meio diluidor de congelamento, nas concentrações testadas, não promoveu um efeito benéfico sobre a viabilidade espermática do espermatozoide equino criopreservado.
With the improvement of the biotechnologies in equine reproduction, it is possible to obtain good reproductive results. Artificial insemination in equine species can be performed either with fresh, cooled or frozen/thawed semen. The preparation of ejaculate for cryopreservation involves several steps since the removal of seminal plasma, which is the predominant source of sperm antioxidant protection. During sperm freezing and thawing, a decrease in the fertilization potential occurs, which is associated with cell damage as a result of increased production of oxygen reactive species (ROS). EROs cause lipid peroxidation in sperm membranes and DNA fragmentation, consequently affecting sperm viability. Melatonin is a potent endogenous antioxidant that helps protect the body against damage from ROS. The presence of melatonin receptors in spermatozoa suggests a possible action over sperm function, exerting some type of regulation on the mechanisms of antioxidant defense. Thus, the aim of this study was to evaluate different concentrations of melatonin on motility, ROS generation, integrity of acrosomal and plasma membranes of cryopreserved semen of Crioulo horses. For this, the rich fraction of 3 ejaculates of 5 stallions was diluted in commercial cooling extender at a concentration between 50 x 106 spz/ml. The samples were centrifuged (600g x 12min) and the pellet resuspended in commercial freezing extender at a final concentration of 200x106 spz/ml. Melatonin was added to the freezing extender with the sperm cells at different concentrations (0; 1,25; 2,5 e 5mM), and immediately filled in 0.5ml straws, sealed and submitted to the cryopreservation process. Samples were thawed at 37°C for 30 seconds and evaluated for motility in a phase contrast microscope, generation of EROs and integrity of acrosomal and plasma membrane by flow cytometry with DCF-DA, FITC-PNA and PI probes respectively. In relation to sperm motility, the group without melatonin and the group with the dose of 1.25mM did not presented difference (P=0.80), being 52.0% ± 2.42 (0) and 50.00% ± 2.18 (1.25mM). However, the groups 2.5 and 5mM had a reduction in motility (42.6% ± 2.28 (2.5mM) and 33.0% ±3.00 (5mM)) (P<0.0004). This same pattern was observed for the effect of acrosome integrity being 75.48% ± 3.24 (0); 80.49% ± 1.62 (1.25mM); 82.94% ± 1.42 (2.5mM) and 84.90% ± 1.51 (5mM) and plasma membrane 66.85% ± 3.13 (0); 66.0% ± 2.42 (1.25mM); 70.07% ± 2.72 (2.5mM) and 74.92% ± 1.98 (5mM). Concerning the generation of ROS, our treatments presented no statistical difference (P>0.05). They were 86.5% ± 2.16 (0); 89.1% ± 1.26 (1.25mM); 89.3% ± 1.04 (2.5mM), 89.4% ± 1.03 (5mM). In conclusion, the addition of melatonin to the freezing extender, in the concentrations tested, did not provide beneficial effect on sperm viability of cryopreserved equine semen.
Biblioteca responsável: BR68.1