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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216823

Resumo

As células tronco mesenquimais (CTMs) são indicadas para a terapia alogênica pois seus riscos de rejeição são significativamente reduzidos, uma vez que não são células apresentadoras de antígenos. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência da criopreservação por longo tempo e das concentrações de SFB (10 e 20%) na: viabilidade, proliferação e potencial de diferenciação de CTMs. Para isso CTMs-TA e CTMs-GW criopreservadas por 43 meses foram submetidas ao processo de caracterização através da citometria de fluxo, teste de proliferação e diferenciação (por imunocitoquímica e expressão gênica). Também foi avaliada a influência de duas concentrações de SFB sobre a expressão gênica de células induzidas e não induzidas à diferenciação adipogênica e osteogênica, sendo observada também a influência, do processo de indução de diferenciação sobre a expressão gênica de CTMS-TA e CTMs-GW. As CTM criopreservadas por longo tempo mantiveram sua viabilidade após a reconstituição e também o potencial de diferenciação osteogênica in vitro confirmada no RT-qPCR. No teste de proliferação realizado com as CTMs-TA e CTM-GW com 10 e 20% de SFB, observamos que as CTMs-TA podem ser cultivadas com qualquer uma das concentrações, porém nas CTMs-GW identificamos que a proliferação é maior quando são cultivadas com 20% de SFB. Através da imunocitoquímica observamos que a concentração de SFB não influencia a diferenciação induzida em nenhuma das duas fontes estudadas. Já a análise da diferenciação espontânea, por imunocitoquimica, mostrou maior acúmulo de gotículas de gordura nas CTMs-TA e CTMs-GW cultivadas com 20% de SFB, indicando a diferenciação espontânea para tecido adipogênico. Este fato não foi confirmado por RT-qPCR, uma vez que não houve a expressão do transcrito PPAR que deveria ser encontrado em células diferenciadas para essa linhagem. Considerando a influência da diferenciação na expressão de transcritos específicos para a linhagem adipogênica as CTMs-TA passaram a expressar menos os AdipoQ e PPAR e mantiveram a baixa expressão do PPAR, nas CTMs-GW não foi observada a expressão do PPAR e manteve a baixa expressão dos AdipoQ e PPAR. Os genes relacionados a diferenciação osteogênica nas CTMs-TA o RUNX2 apresentou maior expressão, enquanto que o OSC foi mantido. Dos genes relacionados a neuroproteção o GDNF apresentou-se mais expresso após a diferenciação adipogênica nas CTMS-GW, o mesmo foi observado quanto ao NES nas duas fontes estudadas. A diferenciação adipogênica influenciou de forma significativa as expressão dos transcritos TP53, CASP3 e BCL2L1 nas CTMs-TA e BCL2L1 nas CTMs-GW, já a diferenciação osteogênica influenciou nas expressão de BCL2L1 e CLU nas CTMS-TA e CTMs-WJ. Concluindo, o protocolo para criopreservação e a manutenção das células foram adequados, porém algumas alterações encontradas como expressão de CD34+ e CD105+ associada à expressão gênica de NES e GDNF podem indicar uma tendência a diferenciação espontânea para a linhagem endotelial. Além disso, nosso trabalho demonstrou que as diferenças na concentração de SFB não influenciam a expressão gênica das células. Contudo podemos sugerir que o processo de diferenciação induziu as CTMs a um estresse, porém as CTMs responderam de forma compensatória à esse estimulo, evidenciando assim suas características terapêuticas.

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Mesenchymal stem cells (MSCs) are recomended for allogeneic therapy because their risks of rejection are significantly reduced since they are not antigen presenting cells. The objective of this work was to investigate the influence of long-term cryopreservation and FBS concentrations (10 and 20%) on viability, proliferation and differentiation potential of MSCs. For this, MSCs from adipose tissue (-AT) and CTMs from Wharton jelly (-WJ) cryopreserved for 43 months were submitted to the characterization process through flow cytometry, proliferation and differentiation test (by immunocytochemistry and gene expression). The influence of two concentrations of FBS on gene expression of cells induced and non-induced for adipogenic and osteogenic differentiation was also evaluated. Long-term cryopreserved MSCs maintained their viability after reconstitution and also the potential for in vitro osteogenic differentiation confirmed in RT-qPCR. In the proliferation test performed with MSC-AT and MSC-WG with 10 and 20% FBS, we observed that the MSC-AT can be grown at any of the concentrations, but in the MSC-WG proliferation is greater when cultivated with 20% FBS. Through immunocytochemistry we observed that the concentration of FBS does not influence the induced differentiation in either sources of cells studied. The analysis of the spontaneous differentiation, by immunocytochemistry, showed greater accumulation of fat droplets in MSC-AT and MSC-WG cultured with 20% FBS, indicating the spontaneous differentiation for adipogenic tissue. This fact was not confirmed by RT-qPCR, since there was no expression of the PPAR transcript that should be found in cells differentiated for this lineage. Considering the influence of the differentiation in the expression of specific transcripts for the adipogenic lineage the MSC-AT express less the AdipoQ and PPAR and maintained the low expression of the PPAR, in the MSC-WG group PPAR expression was not observed and maintained the low expression of AdipoQ and PPAR. From the genes related to osteogenic differentiation in MSC-AT, RUNX2 presented higher expression, while the OSC was maintained. Of the genes related to neuroprotection, GDNF was more expressed after adipogenic differentiation in MSC-WG, the same was observed for NES in the two studied sources. Adipogenic differentiation significantly influenced the expression of the TP53, CASP3 and BCL2L1 transcripts in the MSC-AT and BCL2L1 in the MSC-WG, whereas the osteogenic differentiation influenced the expression of BCL2L1 and CLU in MSC-AT and MSC-WG. In conclusion, the protocol for cryopreservation and cell maintenance were adequate, but some alterations found as increased expression of CD34 + and CD105 + associated with the gene expression of NES and GDNF may indicate a tendency for spontaneous differentiation into the endothelial cell lineage. In addition, our work demonstrated that differences in FBS concentration do not influence gene expression. However, we can suggest that the differentiation process induced the MSCs to a stress, but the MSCs responded in a compensatory way to this stimulus, thus showing its therapeutic characteristics.

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