ANÁLISE DO PERFIL DE METILAÇÃO DO GENE SLC11a1 EM EQUINOS NATURALMENTE INFECTADOS POR CIATOSTOMÍNEOS

RESUMO

Os ciatostomíneos são os parasitos nematóides mais prevalentes em equinos. A infecção por esses parasitos causa prejuízos na criação de equinos, prejudicando o desempenho dos animais, podendo levar ao óbito. O gene SLC11a1 (Solute Like Carrier Family 11a1) está relacionado com a resistência natural do hospedeiro aos patógenos. As características fenotípicas dos animais podem ser influenciadas por mecanismos epigenéticos, como a metilação do DNA. O objetivo desse trabalho foi avaliar o perfil de metilação do DNA no gene SLC11a1 em equinos com alta e baixa contagem de ovos de ciatostomíneos por grama de fezes (OPG). Realizou-se esse exame coproparasitológico de 30 animais da raça Puro Sangue Inglês (PSI) e de 44 cavalos Crioulo. Destes, selecionou-se alguns animais de cada raça, sendo 6 PSI e 3 Crioulo. Os animais selecionados foram os que apresentaram as menores e as maiores contagens de OPG. Desses animais foram pesquisados o perfil de metilação do gene SLC11a1. Além disso, desses e outros animais foram realizados um teste ELISA para detectar IgGs contra as formas larvares de ciatostomíneos encistadas na mucosa. Foram observadas correlações entre a OPG e o ELISA fraca, moderada e forte para as categorias de animais PSI com OPG menores, intermediários e maiores respectivamente com R=0,189; R=0,372 e R=-0,547 respectivamente. Nas mesmas três categorias dos animais Crioulos (menores, intermediários e maiores OPG) as correlações entre os dois testes foram fracas com R=0,136; R=0,280 e R=0,025 respectivamente (sendo que abaixo de 0,3 é baixa; entre 0,3 e 0,5 é moderada; acima de 0,5 é alta; e zero é sem relação). Somente para os animais da raça PSI, avaliou-se também o hematócrito (Ht), contagem diferencial de leucócitos (CDL) e número de prêmios em corridas (somente para éguas PSI adultas). Os resultados de Ht (var. 34 46) e CDL se mostraram dentro dos valores de referência na quase totalidade dos animais. As análises in sílico mostraram que o gene SLC11a1 possui duas ilhas de CpG no corpo do gene de equinos. Após a coleta do sangue dos animais, realizou-se a extração do DNA leucocitário e posterior tratamento com bissulfito de sódio. Ambas as ilhas de CpG foram amplificadas por PCR, purificadas, clonadas e sequenciadas. Os resultados do sequenciamento demonstraram o mesmo padrão de metilação entre os animais com as maiores e as menores contagens de OPG na ilha um (com P=1.0) e na ilha dois (com P=0.105) do gene. A raça dos animais também não influenciou nos resultados de metilação do DNA tanto para a ilha um (P=0.595) quanto para a ilha dois (P=0.639). Houve diferença significativa entre o perfil de metilação da ilha um de CpG e da ilha dois, com P=0.0001. A ilha um do gene se apresentou hipermetilada (>75%) enquanto a ilha dois mostrou-se hipometilada (<30%). Os achados permitiram concluir a ausência de correlação forte entre OPG e o ELISA, a ausência de influência da metilação do DNA na contagem de OPG e indicam uma possibilidade de haver regulação epigenética por metilação do DNA no gene SLC11a1 em equinos.

ABSTRACT

Cyathostomins are the most prevalent nematodes parasites in horses. The infection by these parasites causes damages in the breeding of horses, damaging the performance of the animals, and can lead to death. The gene SLC11a1 (Solute Like Carrier Family 11a1) is related to the host's natural resistance to pathogens. The phenotypic characteristics of the animals may be influenced by epigenetic mechanisms, such as DNA methylation. The objective of this work was to evaluate the profile of DNAs methylation on the SLC11a1 gene in horses with high and low egg counts of cyathostomins per gram of feces (EPG). This coproparasitological exam was performed on 30 animals of the Thoroughbred and on 44 Crioulos horses. Of these, some animals of each breed were selected, being 6 Thoroughbred and 3 Crioulo. The animals selected were the ones with the lowest and the highest EPG counts. From these animals, It was studied the profile of methylation of the SLC11a1 gene. Besides that, from these and another animals they were performed the ELISA test to detect IgGs against the encisted larval forms of cyathostomins. They were observed weak, moderate and strong correlations between the EPG and the ELISA for the categories of PSI animals with lower, intermediate and higher EPG, respectively, with R=0.189; R=0.372 and R=-0.547 respectively. In the same three categories of Crioulo animals (lower, intermediate and higher EPG) the correlations between the two tests were weak with R=0.136; R=0.280 and R=0.025 (being below 0.3 is low, between 0.3 and 0.5 is moderate, above 0.5 is high, and 0 is unrelated). Only for the PSI animals, the hematocrit (Ht), differential leukocyte count (CDL) and number of prizes in races (only for adult Thoroughbred mares) were also evaluated. The results of Ht (var. 34-46) and CDL were within the reference values in almost all animals. In silico analyzes showed that the SLC11a1 gene has two CpG islands in the body of the gene. After collection of blood from the animals, the leukocyte DNA was extracted and then treated with sodium bisulfite. Both CpG islands were amplified by PCR, purified, cloned and sequenced. Sequencing results showed the same pattern of methylation between the animals with the highest and lowest EPG counts on island 1 (with P = 1.0) and island 2 (with P = 0.105). The breed of the animals did not influence the DNAs methylation results for both island 1 (P = 0.595) and island 2 (P = 0.639). There was a significant difference between the DNAs methylation of island 1 of CpG and island 2, with P = 0.0001. Island 1 of the gene was hypermethylated (>75%) while island 2 was hypomethylated (<30%). The findings made it possible to conclude the absence of strong correlation between EPG and the ELISA, the absence of DNAs methylation influence on the EPG counts and indicate a possibility of epigenetic regulation by DNAs methylation on the SLC11a1 gene in horses.