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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-217478

Resumo

A mastite, principal doença dos rebanhos leiteiros, é responsável por até 40% de todas as doenças infecciosas e por significativas perdas econômicas em função da diminuição da produção, gastos com medicamentos, serviços veterinários e descarte de leite. No Brasil, o principal patógeno causador da mastite é Staphylococcus aureus, microrganismo de difícil controle e que apresenta resistência à maioria dos antimicrobianos utilizados na medicina veterinária. Uma nova alternativa para o seu controle baseia-se no uso da nanotecnologia, que é mais eficiente em relação aos antimicrobianos tradicionais, com doses muito mais baixas, diminuindo com isto, os riscos de resíduos no leite e nos tecidos de animais tratados. Neste sentido, o trabalho teve três objetivos. O primeiro objetivo foi a determinação da MIC para S. aureus com AgNp comerciais de 100 nm. Para tal, utilizaram-se 23 amostras de S. aureus isoladas no Laboratório de Microbiologia do Leite da Embrapa Gado de Leite, em Juiz de Fora MG, e fez-se a avaliação em placas de Ágar BHI com diferentes concentrações de AgNp. O resultado da MIC demonstrou que a dose mínima foi de 2,5 mg/mL e que a metodologia tradicional, sugerida pelo CLSI, com uso do caldo MH, não funcionou para a MIC com AgNp. O segundo objetivo do trabalho foi validar uma metodologia para detecção de Ag no leite e em tecidos biológicos (músculo, rim e fígado bovino). As amostras de leite e tecidos, coletadas de animais negativos para resíduos de Ag, foram fortificadas com dosagens conhecidas de AgNp. Após secagem em estufa, as mesmas foram submetidas a digestão e abertura com HNO3 na pré-digestão, associadas ao HCl durante o processo de aquecimento em bloco digestor. A leitura das amostras foi realizada em equipamento de ICP OES. Os resultados demonstram que o método de digestão proposto gera um ótimo sinal, com um desvio padrão menor do que 2%. A técnica de digestão e leitura das amostras é muito eficiente e com sensibilidade testada de no mínimo 0,4975 ppb. A precisão do equipamento foi maior entre 4,98 e 49,75 ppb para detecção de Ag. Os critérios exigidos pela legislação, como Linearidade, Seletividade, Acurácia, Precisão, Limite de Detecção e Limite de Quantificação foram atendidos para todas as matrizes avaliadas. Porém, o método se mostrou robusto apenas para leite e músculo bovino. Em relação ao rim e fígado bovino, o método se mostrou sensível a algumas mudanças na metodologia padrão. O terceiro objetivo do trabalho foi de induzir mastite em seis vacas, com uma das 23 amostras de S. aureus utilizadas na MIC (amostra 619) e, em seguida, tratar com AgNp, na dose estipulada pela MIC. Após o tratamento, foi coletado leite por cinco dias e, no quinto dia, foi efetuada eutanásia das vacas, para coleta de amostras para verificação da presença de resíduos de Ag. Os resultados demonstraram que a aplicação intra-mamária das AgNp nas vacas, resultou em 50% de cura clínica, avaliada pela presença de grumos durante a ordenha e exames clínicos. No entanto, análises microbiológicas do leite demonstraram que não houve cura microbiológica em 100% dos quartos tratados. Em relação à presença de resíduos, após o quinto dia de tratamento, foi detectada uma concentração alta de Ag no leite do quarto mamário tratado (PE) e no fígado dos seis animais. No geral, a metodologia proposta foi eficiente e o ICP OES, demonstra ser uma ótima opção para determinação de Ag em matrizes biológicas. Porém, as AgNp comerciais de 100 nm não foram eficazes para controle e tratamento da mastite por S. aureus

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Mastitis, the main disease of dairy herds, is responsible for up to 40% of all infectious diseases and significant economic losses due to decreased production, spending on medicines, veterinary services and milk disposal. In Brazil, the main pathogen that causes mastitis is Staphylococcus aureus, a microorganism that is difficult to control and resistant to most antimicrobials used in veterinary medicine. A new alternative to its control is based on the use of nanotechnology, which is more efficient than traditional antimicrobials, at much lower doses, thereby reducing the risks of residues in the milk and tissues of treated animals. In this sense, the work had three objectives. The first objective was the determination of MIC for S. aureus with commercial AgNp of 100 nm. For this, 23 samples of S. aureus were isolated at the Milk Microbiology Laboratory of Embrapa Dairy Cattle, in Juiz de Fora, MG, and evaluated on BHI Agar plates with different concentrations of AgNp. The MIC results showed that the minimum dose was 2.5 mg/mL, and that the traditional methodology suggested by the CLSI, using the MH broth, did not work for the MIC with AgNp. The second objective of the study was to validate a methodology for the detection of Ag in milk and in biological tissues (muscle, kidney and bovine liver). Milk and tissue samples, collected from animals negative for Ag residues, were fortified with known AgNp dosages. After drying in greenhouse, they were submitted to digestion and opening with HNO3 in the pre-digestion, associated to HCl during the heating process in a digester block. The samples were read on ICP - OES equipment. The results demonstrated that the proposed digestion method generates a good signal, with a standard deviation of less than 2%. The technique of digestion and reading of the samples is very efficient and with a tested sensitivity of at least 0.4975 ppb. The accuracy of the equipment is higher between 4.98 and 49.75 ppb for Ag detection. The criteria required by the legislation, such as Linearity, Selectivity, Accuracy, Detection Limit and Quantification Limit were met for all matrices evaluated. However, the method proved to be robust only for milk and bovine muscle. In relation to kidney and bovine liver, the method was sensitive to some changes in the standard methodology. The third objective of the study was to induce mastitis in six cows with one of the 23 S. aureus samples used in the MIC (sample 619) and then treated with AgNp at the dose determined by MIC. After the treatment, milk was collected for five days, and on the fifth day cow euthanasia was performed to collect samples to verify the presence of Ag residues. The results showed that intramammary application of AgNp in cows resulted in 50% clinical cure, evaluated by the presence of lumps during milking and clinical examinations. However, microbiological analyzes of the milk showed that there was no microbiological cure in 100% of the treated rooms. Regarding the presence of residues, after the fifth day of treatment, a high concentration of Ag was detected in the milk of the fourth treated mammary (PE) and in the liver of the six animals. In general, the proposed methodology was efficient and ICP-OES, a great option for determination of Ag in biological matrices. However, commercial 100 nm AgNPs were not effective for the control and treatment of S. aureus mastitis.

Biblioteca responsável: BR68.1