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Mitofusinas em oócitos murinos: seus papéis na fertilidade e na herança mitocondrial

THIAGO SIMOES MACHADO.
Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-217503

Resumo

Durante a oogênese o oócito sofre intensas mudanças quanto a morfologia mitocondrial e número de organelas. Uma vez que a fusão e fissão mitocondrial atuam diretamente na dinâmica mitocondrial, tais processos devem ser determinantes para o desenvolvimento oocitário. O formato arredondado e pequeno das mitocôndrias oocitárias sugere que essas organelas sejam incompetentes para a fusão. É possível que tal realidade favoreça a segregação de moléculas de DNA mitocondrial (mtDNA) mutantes. Assim, este projeto teve como objetivo investigar o papel da fusão mitocondrial no oócito e suas consequências tanto para fertilidade quanto para a herança mitocondrial. Para tal, genes-chave para a fusão mitocondrial (Mfn1 e Mfn2) foram nocauteados exclusivamente nos oócitos de camundongos portadores de dois haplótipos mitocondriais, mtDNA C57BL/6 (B6) e NZB/BINJ (NZB). Oócitos selvagens (WT) ou nocautes para Mfn1 (Mfn1 cKO), Mfn2 (Mfn2 cKO) ou ambos (Mfn1&2 cKO) foram comparados quanto a competência de desenvolvimento, função mitocondrial e herança do mtDNA NZB. O acasalamento de fêmeas contendo oócitos Mfn1 cKO com machos WT não resultou em nascimento. Tal infertilidade associou-se à falha na ovulação, acúmulo de folículos e bloqueio da progressão meiótica quando do cultivo in vitro. Oócitos Mfn1 cKO também apresentaram menor diâmetro e menor nível de mtDNA e agregação mitocondrial. Já os oócitos Mfn2 cKO, não foram afetados quanto ao nível de mtDNA. Como resultado, o número de nascimentos não diferiu entre fêmeas Mfn2 cKO e WT. Surpreendentemente, o duplo nocaute resultou em efeito menos severo que o nocaute do Mfn1, sendo que o desenvolvimento folicular não foi comprometido e oócitos Mfn1&2 cKO apresentaram nível intermediário de mtDNA (comparado com oócitos WT e Mfn1 cKO), agregação mitocondrial e do retículo endoplasmático. Apesar de ovulados, os oócitos Mfn1&2 cKO apresentaram bloqueio da maturação meiótica. Como resultado, esses oócitos se mostraram incompetentes em suportarem o desenvolvimento a termo. No que se refere a herança mitocondrial, primeiramente observamos que quanto maior o nível de mtDNA NZB da fêmea doadora, maior a eliminação de mtDNA NZB nos oócitos, pois fêmeas com 60-80% de mtDNA NZB apresentaram oócitos com redução de 13,1% ± 1,99 do mtDNA NZB (NZB). Assim, utilizamos fêmeas de maior quantidade de mtDNA NZB para melhor observar o comportamento de herança. O nível de mtDNA NZB diminuiu em oócitos WT e Mfn1 cKO em comparação com as fêmeas doadoras, sugerindo uma seleção contra o mtDNA mutante. Contudo, tal seleção foi ao menos 50% menos eficaz em oócitos maturos Mfn2 cKO e Mfn1&2 cKO, evidenciando um possível papel desempenhado pelo Mfn2 na eliminação do mtDNA NZB. A mesma análise, quando feita em oócitos imaturos, cauda, fígado e baço, apresentou os mesmos comportamentos reportados em cada grupo. Não foi observada diferença entre as gerações de uma mesma fêmea. Em suma, este trabalho indica que o Mfn1 é essencial para promover oócitos com competência de desenvolvimento, enquanto que o Mfn2 participa da eliminação de mtDNA mutante no oócito. Esses achados dão suporte ao papel-chave das mitofusinas na modulação da dinâmica mitocondrial visando o atendimento às exigências dos oócitos e prevenção da herança de mutações no mtDNA.
During oogenesis the oocyte undergoes intense changes in mitochondrial morphology and number of organelles. Since mitochondrial fusion and fission act directly on mitochondrial dynamics, such processes must be determinant for oocyte development. The small and rounded shape of the oocyte mitochondria suggests that these organelles are incompetent for fusion. This could favor the segregation of mitochondrial DNA molecules (mtDNA) mutants. Thus, this project aimed to investigate the role of mitochondrial fusion in the oocyte and its consequences both for fertility and for mitochondrial inheritance. To that end, key genes for mitochondrial fusion (Mfn1 and Mfn2) were knocked out exclusively in the oocytes of mice bearing two mitochondrial haplotypes, mtDNA C57BL / 6 (B6) and NZB / BINJ (NZB). Wild oocytes (WT) or knockouts for Mfn1 (Mfn1 cKO), Mfn2 (Mfn2 cKO) or both (Mfn1&2 cKO) were compared for developmental competence, mitochondrial function and NZB mtDNA inheritance. The mating of females containing Mfn1 cKO oocytes with WT males did not result in birth. Such infertility was associated with ovulation failure, follicle accumulation, and blockage of meiotic progression during in vitro culture. Mfn1 cKO oocytes also showed smaller diameter and lower level of mtDNA and mitochondrial aggregation. However, the Mfn2 cKO oocytes were not affected in the mtDNA levels. As a result, the number of births did not differ between Mfn2 cKO and WT females. Surprisingly, the double knockout resulted in a less severe effect than the Mfn1 cKO, with follicular development not compromised and Mfn1&2 cKO oocytes had intermediate mtDNA levels (compared to WT and Mfn1 cKO oocytes), mitochondrial and reticulum aggregation endoplasmic. Despite ovulation, the Mfn1&2 cKO oocytes showed blockage of meiotic maturation. As a result, these oocytes proved to be incompetent in supporting full-term development. Regarding mitochondrial inheritance, we first observed that the higher the level of NZB mtDNA of the female donor, the greater is the elimination of NZB mtDNA in the oocytes, since females with 60-80% of mtDNA NZB presented oocytes with a reduction of 13.1% ± 1.99 of NZB mtDNA (NZB). Thus, we used females with higher amounts of NZB mtDNA to better observe the inheritance behavior. The NZB mtDNA level decreased in WT and in Mfn1 cKO oocytes compared to donor females, suggesting a selection against mutant mtDNA. However, this selection was at least 50% less effective in mature oocytes Mfn2 cKO and Mfn1&2 cKO, evidencing a possible role played by Mfn2 in the elimination of mtDNA NZB. The same analysis, when performed on immature oocytes, tail, liver and spleen, presented the same behaviors reported in each group. No difference was observed between the generations of the same female. In summary, this work indicates that Mfn1 is essential for promoting oocytes with developmental competence, whereas Mfn2 participates in the elimination of mutant mtDNA in the oocyte. These findings support the key role of mitofusins in modulating mitochondrial dynamics in order to meet oocyte requirements and prevent inheritance of mtDNA mutations.
Biblioteca responsável: BR68.1