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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-217663

Resumo

As proteases são um grupo de enzimas hidrolíticas, que possuem a capacidade de hidrolisar ligações peptídicas extremamente importantes para indústria, sendo seu uso correspondente a 60% das enzimas comercializadas. Devido essa importância, faz-se necessária a utilização de novas fontes de obtenção ou de novas formas de baratear a produção. Pensando nisso a utilização de resíduos agroindustrial em associação com processos fermentativos pode ser uma forma de obtenção de novas enzimas alem de ajudar a combater os sérios danos ambientais causados pela eliminação desses resíduos na natureza. A Fermentação em Estado Sólido (FES) vem como tentativa de reaproveitamento desse material que pode ser utilizado como um substrato de alta qualidade por um baixo preço para produção de proteases com potencial biotecnológico. O presente trabalho teve como objetivo utilizar Aspergillus sydowii para a produção de protease através da FES, além de purificar a enzima alvo através de processos de cromatográficos, bem como a determinação das características bioquímicas da protease produzida e isolada. O micro-organismo utilizado foi isolado diretamente do café e identificado. Em seguida, foi realizada uma verificação do seu potencial de produção para protease. Para a produção foram avaliados o tempo de fermentação, a umidade e a quantidade de substrato utilizada. Para o processo de purificação foram utilizadas técnicas de precipitação com acetona, colunas cromatográficas utilizando como resina a DEAE-Sephadex e gel filtração Superdex 75. Foram analisados os extratos brutos e purificados. Os extratos foram submetidas à caracterização quanto a sua termoestabilidade, temperatura e pH ótimos, efeitos de inibidores e íons metálicos. O extrato bruto apresentou atividade proteolítica de 412 U/mL, tendo uma inibição de pelo Fenilmetilsulfonilflúor (85%) e o íon Fe+3 aumentou a atividade em 69%. A atividade ótima foi encontrada em pH 8 a 45°C, com estabilidade termica do extrato entre 25°C e 45°C, mantendo 85% de sua atividade inicial. A protease purificada apresentou um tamanho de 48 KDa, a técnica utilizada apresentou um alto rendimento de 5,9 vezes, a recuperação de 53% e a atividade proteolítica de 256 U/mL. A enzima teve uma inibição pelo Fluoreto de Fenilmetilsulfonila (60%) e o íon Cu+2 (56,5%). A atividade ótima foi encontrada em pH 8,0 a 45°C, com estabilidade da enzima entre 35°C e 50°C, mantendo 70% de sua atividade inicial. A linhagem de A. sydowii isolada foi eficaz para a produção de protease com potencial biotecnologico atraves da FES utilizando o resíduo de café, além de uma possivel solução para o dano ambiental provocado pelo borra do café.

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Proteases are hydrolytic enzymes able to hydrolyze peptide bonds and thereby presenting several applications for industrial purposes (corresponding to 60% of the commercial enzymes). Wasting of agro-industrial raw material generates environmental problems at the same time that represents an economic hindrance. Solid State Fermentation emerges as an alternative to reuse this raw material by providing high quality substrate at a low price for the production of proteases with biotechnological potential. The present work aimed to select Aspergillus sydowii strains to perform Solid State Fermentation and then to purify a protease through chromatography process, as well as the determination of its biochemical characteristics. In this study the microorganism cultivated directly in the coffee substrate was isolated and identified regarding to its production potential, the fermentation time, the humidity and the amount of the substrate. For the purification process a number of techniques were used, acetone precipitation, gravitational column using DEAE-Sephadex resin and Superdex 75 gel filtration using the AKTA avant system. Solid state fermentation is a promising technology largely used in a biotechnology process and is a suitable strategy for producing low cost enzymatic products. At the present study, an enzyme obtained through solid state fermentation (SSF) by Aspergillus sydowii was herein purified, characterized and tested for its antimicrobial activity. The fermentations used coffee ground residues as substrate and the crude enzyme was submitted through further purification steps of: cetonic precipitation, chromatography through DEAE-Sephadex column and FPLC system (gel filtration in na Äkta avant system, Superdex 75 collumn). Both crude and purified enzymes were submitted to characterization of their thermostability, optimal temperature and pH, effects of inhibitors and metal ions. A purified protease (48 KDa) was obtained with high yield (5.9 fold) and recovery (53%) with proteolytic activity of 256 U/mL. The enzyme was highly inhibited by phenylmethanesulfonyl fluoride (60%) and the ion Cu+2 (56.5%). The optimal activity was found at pH 8, at 45 °C of temperature, with the enzyme stability between 35° C and 50° C (maintaining 70% of its highest activity). It was possible to determine appropriate conditions to the obtainment of thermostable proteases with biotechnological interest associated with a method that concomitantly shows excellent production levels and recovery waste raw material in a very profitable process.

Biblioteca responsável: BR68.1