SUPLEMENTAÇÃO DE BOVINOS A PASTO COM FONTES DE LIPÍDIOS PROTEGIDOS SOBRE AS CARACTERÍSTICAS SEMINAIS, PARÊNQUIMA TESTICULAR E PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES.

RESUMO

A hipótese do presente estudo é de que o uso de gordura de palma e gordura de soja, protegidos com sais de cálcio e fornecidos via dieta afetam a histologia testicular e melhoram a qualidade do sêmen fresco e congelado de touros Nelores jovens, e pode interferir diretamente no perfil lipídico das células espermáticas e na fertilidade das doses de sêmen crio preservadas a ponto de melhorar a produção in vitro de embriões. No primeiro capítulo o objetivo foi avaliar a qualidade do sêmen fresco e a histologia testicular de 48 touros jovens da raça Nelore distribuídos aleatoriamente em quatro grupos consumindo os seguintes suplementos Controle (CO, suplemento proteico-energético sem adição de gordura protegida); gordura de palma (OP, suplemento controle + adição de 285 g de gordura de palma protegida); gordura de soja (OS, suplemento controle + 285g de gordura de soja protegida) ou associação (OP+OS, suplemento controle + 145 g de gordura de soja protegida + 145 g de palma protegida). O período de suplementação durou 84 dias sendo então realizada a coleta e as avaliações do sêmen e a histologia dos testículos. As variáveis testiculares analisadas foram circunferência escrotal (CE), consistência do testículo esquerdo (CONSTE), volume testicular do lado esquerdo (VOLTE), consistência do testículo direito (CONSTD) e volume testicular do testículo direito (VOLTD). Foram avaliados também os parâmetros seminais do sêmen fresco Turbilhonamento (TURB), Motilidade (MOT), Vigor (VIG), Concentração (CONC) e o Volume seminal (VOL). Além disso, avaliou-se a Atividade Citoquímica mitocondrial (DAB) e a integridade funcional da membrana plasmática (HIPO). Com o auxílio da análise histológica avaliou-se o número de túbulos seminíferos (NTF), a densidade de superfície tubular (DST) e as características morfológicas das células germinativas Célula (área (ARC), perímetro (PTC), circularidade (CIR), diâmetro mínimo (DMiC) e diâmetro máximo (DMaC) e Núcleo (área (ARN), perímetro, circularidade (PTN), diâmetro mínimo (DMiN), diâmetro máximo (DMaN), e relação núcleo/célula (NC). No segundo capítulo o objetivo foi avaliar o sêmen pós descongelamento na produção in vitro de embriões, associando com possíveis mudanças no perfil lipídico dos espermatozóides, após os 84 dias de suplementação foi realizada a criopreservação seminal dos ejaculados dos touros experimentais. No sêmen pós descongelamento as variáveis de movimentação foram avaliadas com técnica assistida por computador (CASA). Analisou-se também a atividade mitocondrial (DAB) e o estresse oxidativo induzido (TBARS induzido). Com o uso de sondas fluorescentes e análise em citometro de fluxo avaliou-se a integridade de membrana plasmática e acrossomal (FITC-PI), o potencial de membrana mitocondrial sonda (JC-1), a quantidade de radicais livres intracelular (CellROX) e a desnaturação do DNA espermático através estabilidade da cromatina (LA). Foi realizada também a análise do perfil lipidico (LIP) dos espermatozóides sendo também testado na produção in vitro de embriões (PIVE). Os dados foram analisados utilizando o programa estatístico SAS (versão 9.3). Primeiro, verificou-se a normalidade e homogeneidade das variáveis e, quando necessário, foram aplicadas mudanças. Os dados foram primeiramente analisados através da ANOVA (análise de variância). Quando encontrada diferença para as variáveis paramêtricas utilizou-se o teste de médias Tukey e para as variáveis não paramétricas utilizou-se do teste Wilcoxon. Na análise de lipidômica utilizou-se de contrastes ortagonais (FC de 1.5, sem usar FDR- taxa de descoberta falsa). Utilizou-se 5% como nível de significância para todas as avaliações. Nas análises do sêmen fresco os animais dos grupos que receberam a suplementação contendo gordura de palma e gordura de soja protegidos, separados ou em associação apresentaram maior circunferência escrotal em comparação aos animais do grupo CO, porém os animais que consumiram dieta contendo oléo de Palma apresentaram maior volume do testículo direito (P= 0,0109) e tendência para menor volume do testículo esquerdo (P=0,0541), além disso apresentaram menor quantidade de túbulos seminíferos e números de células espermatogênica, menor densidade testicular. Por outro lado, apresentaram células com maior diâmetro máximo e maior relação núcleo-célula. Já a diferença estatística encontrada para a variável DAB -3, onde o grupo OP também apresentou diferença em relação aos outros grupos experimentais (P=0,0290) e é reflexo do maior número de espermatozoides DAB 1 nos animais que consumiram gordura de Palma. Já no sêmen pós-descongelamento a suplementação com a associação de gordura de palma e gordura de soja diminuiu a quantidade de espermatozoides com atividade mitocondrial reduzida (DAB 3) e melhorou a porcentagem da movimentação dos espermatozoides de touros Nelores jovens. Observou-se também a diminuição de 79 lipídeos (membrana e armazenamento) em todos os grupos que receberam suplementação com gordura protegida comparando os dias 0 e 86 do período experimental. Ademais, o grupo suplementado com gordura de Palma (OP) teve maior porcentagem de blastocistos (P= 0,0018) na produção in vitro de embriões. Dessa forma, conclui-se que a utilização de 285g de gordura de palma (protegido com sais de cálcio) pode ser uma alternativa de suplementação para melhorar os índices reprodutivos de touros jovens da raça Nelore.

ABSTRACT

The hypothesis of the present study was that testicular histology, fresh and post-thawed semen quality, sperm cells lipid profile and in vitro embryo production of young Nellore bulls could be affected after dietary supplementation with palm and soy oils protected with calcium salts. A review was carried out in order to answer the main questions of dietary supplementation with protected fat. In addition, two scientific papers were written aiming a better understanding of the results regarding dietary supplementation with protected fat in bulls. In the first chapter, the objective was to evaluate fresh semen quality and testicular histology of forty-eight young Nellore breeders. Therefore, the animals were randomly divided in four groups which were fed with the following supplements Control (CO, corn and distillery grains supplement without the addition of protected fat); Palm oil (OP, control supplement + 285 g of protected palm fat); Soy oil (OS, control supplement + 285g of protected soy fat) or combination (OP + OS, control supplement + 145 g of protected soy fat + 145 g of protected palm). The supplementation lasted 84 days, and at the end this period semen collection and evaluation, as well as testicular sampling for histological analysis were performed. Scrotal circumference (SC), testicular consistency of the left testis (LTCONS), testicular volume on the left side (LTV), testicular consistency of the right testicle (RTCONS) and testicular volume of the right testicle (RTV) were assessed. Additionally, fresh semen swirling (SWIR), motility (MOT), vigor (VIG), concentration (CONC), seminal volume (VOL), mitochondrial cytochemical activity (DAB) and functional integrity of the plasma membrane (HIPO) were also evaluated. Histological analysis was performed by determining the number of seminiferous tubules (NTF), tubular surface density (DST) and germ cells morphological characteristics. Thus, for the latter cell area (CAR), perimeter (CPT), circularity (CCIR), minimum diameter (CMiD) and maximum diameter (CMaD); and nucleus area (NAR), perimeter (NPT), circularity (NCIR), minimum diameter (NMiD), maximum diameter (NMaD), and nucleus/cell ratio (NC) were determined. The second chapter aimed to evaluate the sperm fertility of post-thawed semen on in vitro embryo production, and to determine if there was any correlation between this variable and changes in the sperm lipid profile. Therefore, post-thawed sperm movement characteristics were assessed by computer assisted sperm analysis (CASA). Sperm mitochondrial cytochemical activity and induced oxidative stress (induced TBARS) were also analyzed. Flow cytometry with the aid of fluorescent probes determined integrity of the plasma and acrosomal membranes (FITC-PI), mitochondrial membrane potential (JC-1), the amount of intracellular reactive oxygen species (CellROX) and DNA sperm denaturation through chromatin stability (LA). Sperm lipid profile (LIP) was performed and sperm was tested for fertility by in vitro embryo production (IVP). Normality and homogeneity of the variables were verified and, when necessary, changes were applied. Data were subjected to analysis of variance (ANOVA) and compared by the Tukey mean test and Wilcoxon test for parametric and non-parametric variables, respectivelly. Orthogonal contrasts were applied (FC 1.5, without using FDR- false discovery rate) for lipidomic analysis. Level of significance was set at 5%, using SAS statistical program (version 9.3). Fresh semen evaluations showed lower percentage of sperm with less than half of the active mitochondria - DAB 3 (P = 0.0267) in animals supplemented with palm and soy oils (OP + OS). In addition, this finding affected directly the percentage of sperm with total (MOT) and progressive (PROG) motilities. Additionally, animals receiving palm and/or soy oils supplements showed greater scrotal circumference compared to the ones that were not supplemented. Nevertheless, animals fed with an enriched palm oil diet presented a greater right testicle volume (P = 0.0109) and a tendency of a smaller left testicle volume (P = 0.0541). The statistical difference found for the variable DAB 3 on OP group compared to the others experimental groups (P = 0.0290) is a reflection of an increased percentage of DAB 1 sperm in animals that consumed palm oil. In the post-thaw semen, supplementation with palm and/or soybean oils decreased the amount of sperm with reduced mitochondrial activity (DAB 3) and improved the percentage of motile sperm in young Nellore bulls. Sperm lipid profile evaluation showed a decrease of 79 lipids (membrane and storage) in all groups supplemented with protected fat comparing days 0 86 of the experimental period. As for the sperm fertility tested by IVP, palm oil supplementation led to a higher percentage of blastocysts (P = 0.0018). In conclusion, the use of 285g of palm oil (protected with calcium salts) in the animal feed could be used as a supplement alternative to improve reproductive rates of young Nellore bulls.