CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE ZEBRAFISH

RESUMO

O zebrafish apresenta diversas características interessantes, que fazem da espécie um modelo biológico popular para estudos de diversas áreas de pesquisa, resultando em um elevado desenvolvimento de novas linhagens que precisam ser mantidas e preservadas. A criopreservação pode atender essa necessidade de manter os recursos genéticos da espécie, o que torna o desenvolvimento de pesquisas na área de suma importância. Esta tese tem como objetivo principal realizar um levantamento do histórico da pesquisa sobre criopreservação em zebrafish e realizar o desenvolvimento de protocolos de criopreservação de sêmen de zebrafish utilizando diversos tipos de avaliações sobre os danos causados pelo processo criopreservação. O objetivo do primeiro estudo foi realizar uma revisão sistemática sobre a criopreservação de tecidos e células reprodutivas de zebrafish. Na revisão sistemática foi possível identificar e quantificar as principais características dos protocolos de criopreservação já utilizados em diferentes tipos de amostras. Com os resultados obtidos nesse estudo foi possível identificar limitações e tendências para novas pesquisas, além de confirmar que assim como em outras espécies de peixes, a criopreservação de sêmen é o método mais efetivo para preservação do material genético do zebrafish. No segundo estudo objetivou-se avaliar a combinação e interação de diferentes extensores, crioprotetores permeáveis e não permeáveis, analisando os efeitos da criopreservação sobre os espermatozoides através de uma abordagem ampla de variáveis. Nesse estudo foi possível identificar que a utilização do leite em pó na solução crioprotetora promoveu maior proteção aos espermatozoides, especialmente quanto aos danos oxidativos e de DNA. No terceiro estudo o objetivo foi avaliar o estresse oxidativo e os danos no DNA em diferentes etapas do processo de criopreservação. Observou-se que a etapa de congelamento/descongelamento gerou mais danos que a exposição do sêmen aos crioprotetores durante o equilíbrio. Foi possível identificar que a utilização de leite em pó diminuiu a geração de espécies reativas de oxigênio e a fragmentação de DNA, além de promover maior atividade antioxidante. Com todos os resultados obtidos foi possível observar que a criopreservação de sêmen de zebrafish atualmente é a alternativa mais concreta para preservação do material genético da espécie, e que os protocolos de criopreservação de sêmen devem ser otimizados levando em consideração uma abordagem mais ampla das variáveis. Os bons resultados obtidos com a inclusão do leite em pó na solução crioprotetora indicam que a combinação entre crioprotetor permeável e não permeável pode melhorar os resultados obtidos após o processo de criopreservação.

ABSTRACT

The zebrafish has several interesting characteristics, which make the species a popular biological model for studies in several research areas, resulting in a high development of new strains that need to be maintained and preserved. Cryopreservation can meet the need to maintain the genetic resources of the species, which makes the development of research in the area of extreme importance. The main objective of this thesis is to carry out a survey of the history of research on cryopreservation in zebrafish and to develop protocols for cryopreservation of zebrafish semen using different types of assessments on the damage caused by the cryopreservation process. The aim of the first study was to conduct a systematic review on the cryopreservation of zebrafish reproductive tissues and cells. In the systematic review, it was possible to identify and quantify the main characteristics of the cryopreservation protocols already used in different types of samples. With the results obtained in this study, it was possible to identify limitations and trends for new research, in addition to confirming that as in other fish species, cryopreservation of semen is the most effective method for preserving zebrafish genetic material. In the second study, the objective was to evaluate the combination and interaction of different extenders, permeable and non-permeable cryoprotectants, analyzing the effects of cryopreservation on sperm through a wide approach of variables. In this study, it was possible to identify that the use of powdered milk in the cryoprotective solution promoted greater protection for sperm, especially regarding oxidative and DNA damage. In the third study, the objective was to assess oxidative stress and DNA damage at different stages of the cryopreservation process. It was observed that the freeze/thaw stage generated more damage than the semen exposure to cryoprotectants during equilibrium. It was possible to identify that the use of powdered milk decreased the generation of reactive oxygen species and the fragmentation of DNA, in addition to promoting greater antioxidant activity. With all the results it was observed that the zebrafish sperm cryopreservation is currently the most concrete alternative to preserving the genetic material of the species, and that semen cryopreservation protocols must be optimized considering a broader approach of the variables. The good results obtained with the inclusion of powdered milk in the cryoprotective solution indicate that the combination of permeable and non-permeable cryoprotectants can improve the results obtained after the cryopreservation process.