Can the Dispersion Methods affect the In Vitro Ruminal Evaluation of Substrates with Different Fermentabilities?

RESUMO

Os animais ruminantes estão entre os principais emissores de metano (CH4). Como tal, esforços têm sido feitos para desenvolver estratégias de alimentação para ruminantes que mitiguem a produção de CH4. A incubação in vitro é uma das formas de avaliar a produção entérica de gases de efeito estufa (CH4 e dióxido de carbono, CO2), que simula em laboratório o processo de fermentação que ocorre no ambiente ruminal. Durante a fermentação ruminal in vitro, a amostra é diretamente dispersa no meio, porém tornou-se comum o uso de bolsas filtrantes F57 (Ankom®) para quantificar a fração indigestível. No entanto, devido ao seu alto custo, alternativas como o tecido não tecido (NWT - 100 g/m2) têm sido utilizadas, porém não avaliadas em um sistema de produção de gás in vitro. Assim, nosso objetivo foi avaliar os produtos da fermentação in vitro e as emissões entéricas do efeito estufa (CH4 e CO2) de substratos com diferentes relações forragemconcentrado quando incubados com N2 headspace dentro de bolsas NWT ou F57 em comparação com a dispersão direta no meio (DIS). O experimento foi conduzido de acordo com um planejamento fatorial 3 × 3 com 3 métodos de entrega (amostras incubadas diretamente dispersas no meio, dentro de bolsas F57 ou dentro de bolsas NWT) e 3 tipos de substratos com diferentes proporções de forragem concentrado (FC) (1000, feno de grama tropical de baixa qualidade apenas; 5050, uma proporção igual de mistura de concentrado e feno de grama tropical de baixa qualidade; e 0100, mistura de concentrado apenas). O fluido ruminal foi coletado de 2 novilhos Holandeses canulados. A fermentação em lote in vitro foi realizada em um aparelho comercial de produção de gás sem fio (GP) (AnkomRF GP System, Ankom Technology®) durante 48h de incubação. Houve interações substrato × métodos de entrega (P 0.01) no GP às 24h (GP24) GP às 48h (GP48), matéria seca in vitro (IVDMD) e digestibilidades da matéria orgânica (IVOMD), enquanto nenhum efeito de interação foi observado no pH (P > 0.05). O GP48, IVDMD e IVOMD apresentaram resultados semelhantes em diferentes tipos de substratos. As digestibilidades GP48 e in vitro do substrato de razão 0100 FC foram maiores em DIS, intermediárias em NWT e menores em F57 (P < 0.05). Com a incubação do substrato de proporção FC de 5050, não houve diferenças na GP48 e digestibilidades in vitro entre DIS e NWT (P > 0.05), mas foram maiores que F57. O GP48 e as digestibilidades em NWT foram maiores do que DIS e F57 (P < 0.05) quando os substratos de relação FC de 1000 foram incubados. O pH foi afetado pelo substrato (P < 0.001), onde o aumento da inclusão de concentrado diminuiu linearmente o pH de 7.52 para 7.00 (P < 0.001). Em 24h de incubação, não houve interação (P > 0.05) entre substratos e método de entrega de CH4 e produção de CO2 (mL/L) e proporção (mL/g DMi e mL/g MOd). A proporção e produção de CH4 e CO2 em relação a DMi apresentaram aumento linear com o aumento da razão FC (P < 0.01). Por outro lado, com o aumento da razão FC incubada, houve uma diminuição linear (P = 0.017) na produção de CH4 e CO2 em relação a MOd. Em 48h de incubação, houve interações entre substratos e método de entrega (P < 0.01) na produção de CH4 e CO2 em relação a DM incubado (mL/g DMi), mas não na produção em relação a OM digerida (mL/g OMd; P >xi 0.05). As proporções de CH4 e CO2 foram maiores quando o substrato 0100 FC foi disperso no meio do que incubado dentro das bolsas F57 e NWT, que não diferiram entre elas. O CH4 e CO2 em relação a DM incubada de substrato 0100 FC pelo DIS foi maior que os demais métodos. Para o substrato de relação FC 5050, CH4 no DIS foi semelhante ao NWT que foi igual a F57, enquanto para substratos 1000 não houve diferença entre os métodos. Não houve diferenças entre os métodos na produção de CO2 (mL/g DMi) quando os substratos 1000 foram incubados, mas para o substrato de proporção 0100, o CO2 no DIS foi maior do que a incubação dentro dos sacos. A produção de CH4 em relação ao OM digerido em 48h de incubação reduziu linearmente em resposta ao aumento da razão FC (P < 0.001). Não houve interações entre método × substrato (P > 0.26) nas proporções molares de AGV dos indivíduos (ou seja, acético, propiônico e butírico), razão acético/propiônico e AGV total. Os diferentes métodos de entrega afetam a proporção molar de ácido propiônico e a proporção acético/propiônico (P < 0.04). O ácido propiônico (mol/100 mol) apresentou maiores valores quando os substratos foram incubados em bolsas do que dispersos no meio (P < 0.03), mas não foram encontradas diferenças para F57 e NWT (P = 0.92). O tipo de substrato afetou (P < 0.01) a alteração do total de AGV expresso em relação a MO incubada e digerida, mas não (P > 0.62) para CH4 e CO2 em relação ao VFA. Diminuir a proporção da razão FC no substrato geralmente aumentou VFA/OMi, enquanto diminuiu VFA/OMd. Além disso, o método de entrega de substrato afetou CH4/VFA e CO2/VFA (P < 0.04). O método de dispersão apresentou CH4/VFA semelhante ao NWT (P = 0.39) que foi igual a F57 (P = 0.08). No entanto, em relação a CO2/VFA, a incubação em sacos apresentou menor emissão relativa (P < 0.001) do que quando disperso no meio (0.31 vs 0.71), enquanto F57 e NWT não foram diferentes (P = 0.23). Pode-se concluir que a emissão de gases de efeito estufa, a digestibilidade e a relação acético/propiônico são menores quando os substratos são incubados em bolsas de filtro em comparação com quando são diretamente dispersos no meio. No entanto, as variáveis avaliadas nas bolsas de filtro F57 e NWT apresentaram resultados fortemente correlacionados com o método de dispersão, embora F57 apresente algumas vantagens melhores do que as bolsas NWT, mas mais estudos são necessários para comparar e validar os métodos avaliados em relação aos dados in vivo. fermentação de substratos com alta fermentabilidade dentro dos sacos de fibra usados para análise in vitro, redução da produção de gás, digestibilidades e emissão entérica de gases de efeito estufa em comparação com substratos dispersos no meio. Essas diferenças tornaram-se menos evidentes quando substratos com menor fermentabilidade são incubados e o NWT substitui os sacos F57.

ABSTRACT

Ruminant animals are among the main methane (CH4) emitters. As such, efforts have been made to develop feeding strategies for ruminants that mitigate CH4 production. The in vitro incubation is one of the ways to evaluate enteric greenhouse gas production (CH4 and carbon dioxide, CO2), which simulates in the laboratory the fermentation process that occurs in the rumen environment. During the ruminal in vitro fermentation, sample is directly dispersed in the medium, however it has become common to use the F57 filter bags (Ankom®) to quantify the indigestible fraction. Nevertheless, due to its high cost, alternatives such as non-woven textile (NWT 100 g/m2) have been sought, however has not been evaluated in an in vitro gas production system. Thus, our objective was to evaluate the in vitro fermentation products and enteric greenhouse emissions (CH4 and CO2) of substrates with differents forageconcentrate ratios when incubated with N2 headspace within NWT or F57 bags compared to directly dispersion in the medium (DIS). The experiment was conducted according to a 3 × 3 factorial design with 3 delivery methods (samples incubated directly dispersed in the medium, within F57 bags, or within NWT bags) and 3 types of substrates with different forageconcentrate (FC) ratios (1000, low-quality tropical grass hay only; 5050, an equal proportion of concentrate mixture and low-quality tropical grass hay; and 0100, concentrate mixture only). Rumen fluid was collected of 2 cannulated Holstein steers. The in vitro batch fermentation was carried out using a commercial wireless gas production (GP) apparatus (AnkomRF GP System, Ankom Technology®) during 48h of incubation. There were substrate × delivery methods interactions (P < 0.01) on GP at 24h (GP24) GP at 48h (GP48), in vitro dry matter (IVDMD) and organic matter digestibilities (IVOMD), while no interaction effect was observed on pH (P > 0.05). The GP48, IVDMD, and IVOMD presented similar results on different types of substrates. The GP48 and in vitro digestibilities of the 0100 FC ratio substrate were highest in DIS, intermediate in NWT and smallest in F57 (P < 0.05). With 5050 FC ratio substrate incubation, there were no differences on GP48 and in vitro digestibilities between DIS and NWT (P > 0.05), but they were greater than F57. The GP48 and digestibilities in NWT were greater than DIS and F57 (P < 0.05) when 1000 FC ratio substrates were incubated. The pH was affected by substrate (P < 0.001), where the increasing concentrate inclusion linearly decreased pH from 7.52 to 7.00 (P < 0.001). In 24h of incubation, there was no interaction (P > 0.05) between substrates and delivery method for CH4 and CO2 production (mL/L) and proportion (mL/g DMi and mL/g MOd). The CH4 and CO2 proportion and production relative to DMi presented linearly increase when FC ratio increased (P < 0.01). On the other hand, with the increase in FC ratio incubated, there was a linear (P = 0.017) decrease in CH4 and CO2 production relative to MOd. In 48h of incubation, there were interactions between substrates and delivery method (P < 0.01) on CH4 and CO2 production relative to DM incubated (mL/g DMi), but no on production relative to OM digested (mL/g OMd; P > 0.05). The CH4 and CO2 proportions was greater when 0100 FC substrate was dispersed in the medium than incubated within F57 and NWT bags, which did not differ between them. The CH4 andxiii CO2 in relation to DM incubated of 0100 FC substrate by using DIS was greater than the others methods. For the 5050 FC ratio substrate, CH4 at DIS was similar to NWT which was equal to F57, while for 1000 substrates there was no difference between the methods. There were no differences between methods on CO2 production (mL/g DMi) when 1000 substrates were incubated, but for 0100 ratio substrate, CO2 at DIS was greater than the incubation within bags. The CH4 production relative to OM digested at 48h of incubation linearly reduction in response to increase of FC ratio (P < 0.001). There were no interactions between method × substrate (P > 0.26) on molar proportions of individuals VFA (i.e. acetic, propionic, and butyric), acetic/propionic ratio, and total VFA. The different delivery methods affect molar proportion of propionic acid and acetic/propionic ratio (P < 0.04). The propionic acid (mol/100 mol) presented higher values when substrates were incubated into bags than dispersed in the medium (P < 0.03), but no differences were found for F57 and NWT (P = 0.92). The substrate type affected (P < 0.01) change of total VFA expressed in relation to OM incubated and digested, but no (P > 0.62) for CH4 and CO2 in relation to VFA. Decreasing the proportion of FC ratio in the substrate generally increased VFA/OMi, while decreased VFA/OMd. In addition, substrate delivery method affected CH4/VFA and CO2/VFA (P < 0.04). The dispersion method presented similar CH4/VFA to NWT (P = 0.39) which was equal to F57 (P = 0.08). However, regarding CO2/VFA, incubation into bags showed lower relative emission (P < 0.001) than when dispersed in the medium (0.31 vs 0.71), while F57 and NWT were not different (P = 0.23).As conclusion, the greenhouse gases emission, digestibility, acetic to propionic ratio are lower when substrates are incubated within filter bags compared with when they are directly dispersed in the medium. However, variables evaluated in F57 and NWT filter bags presented strongly correlated results with the dispersion method, although F57 present some better advantages than NWT bags, but more studies are needed to compare and validate the methods evaluated against in vivo data.