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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-218115

Resumo

O cultivo de camarão marinho vem se expandido mundialmente desde o inicio do século, e o camarão branco do Pacífico (Litopenaeus vannamei) é a espécie mais cultivada. Embora a carcinicultura apresente crescimento expressivo, a manifestação de enfermidades dificulta seu avanço. A doença causada pelo vírus da mionecrose infecciosa (IMNV), primeiramente relatada no nordeste brasileiro em 2002, ainda provoca significativas perdas na carcinicultura brasileira. Dentre as alternativas de combate a infecções virais, o RNA de interferência (RNAi) é promissor, pois há evidências da eficácia na aplicação dessa técnica no tratamento dessas enfermidades. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a dinâmica da expressão de genes imunológicos em camarões L. vannamei infectados experimentalmente com o IMNV e tratados com moléculas de dsRNA produzidos in vivo pelo Bacillus subtilis JJBs3 contendo a sequência do ORF1a referente ao IMNV. Num primeiro experimento, foi realizado o acompanhamento do desenvolvimento da mionecrose infecciosa para duas diluições (1,02 x 104 e 1,02 x 103 cópias/100 l) de um extrato de tecido infectado por IMNV, por quantificação das cópias virais por RT-qPCR e métodos histopatológicos; foram validados os extratos IMNV e SPF (livre de IMNV, WSSV e IHHNV) através de infecção experimental por injeção intramuscular, com duração de 22 dias. Os grupos infectados com o extrato IMNV apresentaram curvas de sobrevivência com diferenças significativas (p<0,05) em relação aos dois grupos controle (solução salina e extrato de tecido SPF), bem como alterações histopatológicas. Foram verificadas ainda, diferenças significativas (p<0,05) na carga viral dos tratamentos III e IV entre o 2° pré e o 6° dia pós-injeção, dentre os três pontos de coleta, com valores médios de 1,33 x 102 a 1,59 x 107 cópias virais, respectivamente. A expressão dos genes imunológicos (Sid-1, Dicer-2, Argonauta-2, proPO-1 e PPAE-1), avaliada por qPCR e aplicando o método 2-Cq, apresentou diminuição ao longo do experimento, com exceção do Sid-1 e Argonauta-2 no tratamento com menor dose viral. No segundo experimento (25 dias; seis tratamentos; quatro pontos de coleta), foi avaliado o efeito de diferentes doses (0.5, 1.0, 3.0 e 5.0 g de dsRNA por grama de camarão) produzidas in vivo pelo Bacillus subtilis JJBs3, ministradas através de injeção intramuscular dois dias antes do desafio. Foram utilizados dois grupos controles, em um deles os animais foram injetados com solução salina e extrato de tecido SPF (negativo), e no outro com solução salina e extrato de tecido infectado (positivo). Alterações histopatológicas características de IMN e diferenças significativas (p<0,05) na carga viral entre o 2° pré e 8° dia pós-injeção foram verificadas nos tratamentos que receberam injeção com extrato IMNV. Não foram observadas diferenças na sobrevivência ou na expressão dos genes analisados ao longo do experimento, mostrando que da forma e nas condições em que foram ofertadas, as dsRNAs não surtiram efeito protetivo. Por se tratar de um novo modelo de produção de dsRNA, as técnicas de obtenção, purificação, quantificação e métodos de entrega dessas moléculas precisam ser aprimoradas.

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Shrimp farming is one of the fastest growing aquaculture activities in the world and the Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) is the most widely cultivated species. Although shrimp farming shows significant growth, the manifestation of diseases hinders its progress. The disease caused by the Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) causes significant losses in Brazilian shrimp farming. Recent evidence has suggested that interference RNA (RNAi) could be a viable alternative to control viral diseases. The present work aimed to evaluate the dynamics of immunological gene expression in L. vannamei shrimp experimentally infected with IMNV and treated with dsRNA molecules produced in vivo by Bacillus subtilis JJBs3 containing the IMNV sequence of ORF1a. In a first experiment, the progress of the infection caused by two dilutions (1.02 x 104 and 1.02 x 103 copies / 100 l) of an IMNV-infected tissue extract was monitored by quantifying viral copies by RT- qPCR and histopathological methods; IMNV and SPF (free from IMNV, WSSV and IHHNV) extracts were validated through experimental intramuscular injection infection lasting 22 days. Groups infected with IMNV extract showed survival curves with significant differences (p<0.05) in relation to the two control groups (saline solution and SPF tissue extract), as well as histopathological alterations. Significant differences (p<0.05) in viral load were observed in treatments III and IV between the 2nd and 6th day after infection, among three collection points, with average values of 1.33 x 102 to 1.59. x 107 viral copies, respectively. Expression of immunological genes (Sid-1, Dicer-2, Argonaut-2, proPO-1 and PPAE-1), was evaluated by qPCR, applying the 2-Cq method. In most cases expression reduction was observed. However, Sid-1 and Argonaut-2 showed expression increase in the treatment with the lowest viral dose. In the second experiment (25 days; six treatments; four sampling points), the effect of different doses (0.5, 1.0, 3.0 and 5.0 g dsRNA per gram of shrimp), administered by intramuscular injection two days before the challenge, was monitored. Two control groups were used, in one of them the animals were injected with saline and SPF tissue extract (negative), and in the other, with saline and infected tissue extract (positive). Histopathological changes characteristic of IMN and significant differences (p<0.05) in viral load between the 2nd and 8th post-injection day were verified in cases where IMNV was applied. No differences were observed in the extent or expression of the genes analyzed throughout the experiment, suggesting that in the present conditions dsRNAs had no protective effect. Because this is a new model of dsRNA production, the techniques of use, purification, quantification as well as the delivery methods of these molecules need to be improved.

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