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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-218167

Resumo

Myxozoa são cnidários, endoparasitas obrigatórios, caracterizados por transmissão aos hospedeiros via esporos. Em seu complexo ciclo biológico, estes parasitas infectam vários tecidos e órgãos de vertebrados, principalmente peixes e anelídeos, que são os hospedeiros invertebrados. São importantes patógenos de peixes, e apresentam grande impacto econômico na aquicultura e na pesca comercial, inclusive no Brasil. São cerca de 2.400 espécies descritas parasitando peixes e invertebrados aquáticos no mundo inteiro e na América do Sul foram registradas aproximadamente 120 espécies descritas em peixes de diferentes espécies e bacias hidrográficas e também em peixes de pisciculturas. Em particular, esse estudo teve como objetivo otimizar um método para detectar a presença de DNA de mixosporídeos em amostras de água de pisciculturas, através de técnicas de PCRs. Oferecendo um método simples detecção, precoce, e que avalie o risco de surtos e doenças que causam altas taxas de mortalidades. Foram coletadas amostras de água de duas pisciculturas do interior do estado de São Paulo em diferentes pontos dos tanques, essas amostras foram armazenadas em gelo e conduzidas para o laboratório. No laboratório as amostras de água suspeitas quanto a presença de DNA de mixosporídeos foram processadas seguindo as etapas: filtração, com um sistema completo de filtração à vácuo através de uma membrana de nitrato de celulose de porosidade de 0.45 m e 47 mm de diâmetro; Tratamento das membranas de celulose com acetona P.A; Extração de DNA da membrana de nitrato de celulose; Reação de cPCR e qPCR com primers escolhidos a partir de outros estudos, e primers desenhados para esse estudo. A metodologia utilizada para a filtração mostrou-se eficiente para a obtenção de DNA de mixosporídeos presentes na água. As concentrações de DNA obtidas das amostras de água suspeitas variaram entre 1,6 ng/µL a 53,2 ng/µL, com um valor médio de 9,747 ng/µl. Foram realizadas reações de cPCR e qPCR para 48 amostras suspeitas das coletas realizadas na piscicultura. Das 48 amostras suspeitas 24 (cPCR) e 40 (qPCR) mostraram-se positiva quanto a presença de DNA de mixosporídeos nas amostras de água coletadas. As sequências dessas amostras foram alinhadas e editada manualmente através do programa BioEdit para a obtenção de um único contig. Os resultados obtidos mostraram que amplas as técnicas (cPCR e qPCR) são capazes de detectar os mixosporídeos em amostras de água, entretanto a reação de qPCR mostrou-se mais sensível quando comparados os resultados obtidos em ambas as técnicas, além de quantificar a carga parasitaria das amostras coletas nos tanques.

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Myxozoa are cnidarians, mandatory endoparasites, characterized by transmission to hosts via spores. In its complex biological cycle these parasites infect various vertebrates tissues and organs, mainly fish and annelids, that are invertebrate hosts. They are important pathogenic agent to fish, and present a huge economic impact in fish farming and commercial fishing, including in Brazil. There have been about 2400 species described parasitizing fish and aquatic invertebrate all over the world and in South America 120 species were recorded in diferent fish species and in diferent river basins and in fish farming. Particularly, this study aimed to optimize a method to detect the presence of myxosporeans DNA in water samples of fish farming, by PCRs techniques. Offering a simple and earlier detection method that could evaluate the risk of and diseases outbreak that lead to high mortality rate. Samples of water from a fish farming in São Paulo country side were collected from diferent sites, these samples were stored on ice and taken to laboratory. The water samples containing myxosporeans DNA presence were processed according to the stages: vacuum filtration by cellulose nitrate membrane with porosity of 0.45 m and 47 mm diameter; Treatment of cellulose membrane with acetone; DNA extraction from nitrate celulose membrane; Reaction of cPCR and qPCR with primers chosen from other studies, and primers obtained from this study. The methodology applied for the filtration has been proved efficient for the acquisition of DNA myxosporeans existing in water. DNA concentrations obtained from the suspected water samples ranged from 1,6 ng/µL to 53,2 ng/µL, with a mean value of 9,747 ng/µl. Reactions of cPCR and qPCR were carried out for 48 suspected samples from the fish farming. From these 48 suspected samples 24 (cPCR) and 40 (qPCR) proved to be positive to the DNA myxosporeans presence. The sequence of samples were aligned and adjusted manually through BioEdit program for acquisition of a single contig. The results obtained showed that both techniques (cPCR and qPCR) are able to detect myxosporeans in water samples, however the qPCR reaction proved to be more sensible when compared to the results obtained in both tecniques, in addition to quantify parasite load of the colleted samples.

Biblioteca responsável: BR68.1