IDENTIFICAÇÃO DE VARIAÇÕES ESTRUTURAIS DO GENOMA DE BOVINOS GIR LEITEIRO

RESUMO

O Gir Leiteiro resulta da seleção fenotípica de animais da raça zebuína Gir com maior aptidão para produção de leite. Esses animais possuem tolerância ao calor, às doenças e aos parasitas tropicais. Essas características adaptativas tornam o Gir Leiteiro um recurso genético importante para a produção de leite nos trópicos. O estudo e caracterização de variantes estruturais (SV) do DNA desses indivíduos relacionadas a características adaptativas, de sanidade e produtivas são de interesse para o melhoramento genético da raça. Um exemplo de variações estruturais estudadas é a variação no número de cópias (CNV), que compreende deleção ou duplicação de um segmento de DNA em relação ao genoma referência. Esse tipo de SV envolve muitos pares de bases, sendo capaz de alterar a expressão gênica e de ocasionar alterações fenotípicas. Os objetivos deste trabalho foram (1) detectar CNV no genoma de bovinos Gir Leiteiro; (2) identificar regiões de CNV (CNVR) de alta confiabilidade; (3) determinar as regiões genômicas em que ocorrem as CNV que coincidem com regiões de interesse, tais como genes e Quantitative trait loci (QTL) previamente relacionados às características de sanidade, reprodução e produção de leite; (4) categorizar funcionalmente os genes sobrepostos às CNV e identificar as vias biológicas enriquecidas. Após o controle de qualidade, dados de intensidade de sinal de genotipagem de SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) provenientes do ensaio Bovine HD SNPChip de 545 indivíduos e dados oriundos de sequenciamento de genoma completo de 38 touros foram utilizados para a detecção de CNV. Ao total, 547 animais foram utilizados, dos quais 36 possuíam informação de painel de SNP e sequenciamento. Para a identificação das CNV nos dados de genotipagem foi utilizado o modelo oculto de Markov por meio do programa PennCNV e, nos dados de sequenciamento, foram utilizadas as metodologias de Read Depth, por meio do programa CNVnator e, Split-Read e Read Pair, pelo programa DELLY. O genoma referência ARS_UCD1.2 foi utilizado para o alinhamento das amostras de sequenciamento e para o mapa de SNP. Dois conjuntos de regiões de CNV (CNVR) de alta confiança foram definidos, contendo variantes encontradas nos dados de painéis de SNP e de sequenciamento. Esses conjuntos foram relativos às CNVR presentes em, no mínimo, 5% da população estudada (CNVR_POP) e aos indivíduos representativos da população Gir Leiteiro (CNVR_ANI). No conjunto CNVR_POP, foram encontradas dez CNVR, que representam 1,04 Mb do genoma bovino. No conjunto CNVR_ANI, foram encontradas 45 CNVR, que somadas representam mais de 4,4 Mb do genoma bovino. Os dois conjuntos de CNVR de alta confiança foram unidos para análise funcional resultando em 48 CNVR únicas e de alta confiança. Essas se sobrepuseram a 69 genes, incluindo FILIP1, SENP6, CA5A, BANP, HERC2, RHOU, GBP2, GBP4, GBP6, BLA-DQB, ENSBTAG00000037605 e genes de receptores olfativos. Na análise de enriquecimento, dois termos de Gene Ontology (GO) (FDR<0,05) e 17 termos da plataforma Medical Subject Headings (MeSH) (pajustado< 0,05) foram enriquecidos significativamente. Nas CNVR únicas e de alta confiança foram encontrados 44 Quantitative trait loci (QTL) significativamente associados (p<0,05) a produção (29,54%), reprodução (22,73%), conformação (18,18%), sanidade (13,64%), leite (13,63%), e carne e carcaça (2,27%). As CNVR iv presentes no conjunto CNVR_POP podem ser consideradas como regiões de polimorfismos no número de cópia, pois estão presentes em mais de 1% da população estudada. Em adição, esse conjunto pode ser utilizado como critério de escolha de CNV a serem validadas, como por exemplo, por PCR. Este estudo poderá auxiliar na escolha de SNP que estejam sobrepostos às CNV para o desenvolvimento de painéis de genotipagem para o Gir leiteiro. Ainda, a inclusão de CNVR na avaliação genômica poderá trazer benefícios para o processo de seleção e deve ser verificada. Nossos resultados abrangem a identificação e caracterização de 48 CNVR de alta confiança no genoma de bovinos Gir Leiteiro, o que contribui para a elaboração de um mapa de SV na raça Gir e para o melhor entendimento do genoma dos zebuínos. As CNVR identificadas neste estudo podem afetar potencialmente genes que estão envolvidos no processo evolutivo e no controle fenotípico de característica de interesse para a cadeia produtiva leiteira, como imunidade, lactação, reprodução, reconhecimento de estímulos e sanidade.

ABSTRACT

The Dairy Gir cattle results from the selection of animals from the Zebu Gir breed with greater aptitude for milk production. These animals are tolerant of heat, disease, and tropical parasites. These adaptive traits make the Dairy Gir an important genetic resource for milk production in the tropics. The study and characterization of structural variants (SV) of the DNA of these animals related to adaptive, healthy, and productive traits are interesting to the animal breeding of the breed. An example of structural variants is copy number variation (CNV), which comprises deletion or duplication of a DNA segment compared to the reference genome. The CNV can alter the gene expression and consequently change phenotypes because it encompasses many base pairs. The objectives of the work were (1) detect CNV in the genome of Dairy Gir cattle; (2) identify high-confidence CNVR; (3) determine the genomic regions overlapping CNVR that coincide with the interest regions, such as genes and Quantitative Trait Loci (QTL) previously related to health, reproduction, and milk production traits; (4) functionally categorize genes overlapped with CNVR and identify the enriched biological pathways. After the quality control, luminosity data from 545 individuals genotyped with Illumina BovineHD BeadChip and whole-genome sequencing data from 38 bulls were used to detect CNV. In total, 547 Dairy Gir animals were used, and 36 animals had both types of information. To identify the CNV in the SNP (single nucleotide polymorphism) array data, the hidden Markov model methodology was used by the PennCNV software and, in the sequencing data, the Read Depth methodology was used by the CNVnator software, and Split-Read and Read Pair methodologies by the DELLY software. The reference genome ARS_UCD1.2 was used for the alignment and the SNP map. Two sets of high confidence CNV regions (CNVR) were defined, containing variants found in the SNP array and sequencing data. These sets are related to the CNVR present in at least 5% of the studied population (CNVR_POP) and the representative animals of the Dairy Gir population (CNVR_ANI). In the CNVR_POP set, ten CNVR were found, covering 1.04 Mb of the bovine genome. In the CNVR_ANI set, 45 CNVR were found, which together cover more than 4.4 Mb of the bovine genome. The two high confidence CNVR sets were merged for functional analysis, resulting in 48 unique and high-confidence CNVR. These overlapped 69 genes, including FILIP1, SENP6, CA5A, BANP, HERC2, RHOU, GBP2, GBP4, GBP6, BLA-DQB, ENSBTAG00000037605, and odorant receptors genes. In the enrichment analysis, two Gene Ontology (GO) terms (FDR<0.05), and 17 terms (padjusted< 0.05) from the Medical Subject Headings (MeSH) platform were significant. In the unique and high confidence CNVR, 44 Quantitative trait loci (QTL) were significantly associated (p<0,05) with production (29.54%), reproduction (22.73%), conformation (18.18%), health (13.64%), milk (13, 63%), and meat and carcass (2.27%). The CNVR in the CNVR_POP set may be considered regions of copy number polymorphism since they are present in more than 1% of the studied population. In addition, this set can be used to choose the CNV to be validated, such as by PCR. This study may support the selection of markers that flanks CNV to the development of SNP arrays for the Dairy Gir. Also, the inclusion of CNVR in the genomic evaluation could benefit the selection process and must be verified. Our results include the identification and characterization of 48 high-confidence CNVR in the genome of Dairy Gir cattle. These data contribute to elaborate an SV map in the vi Gir breed and a better understanding of the genome of the zebu cattle. The CNVR identified in this study may potentially affect genes involved in the evolutionary process and the phenotypic control of traits of interest to the dairy products market, such as immunity, lactation, reproduction, stimulus recognition, and health.