Potencial terapêutico das proteínas imunorregulatórias recombinantes: produção heteróloga, caracterização e avaliação da atividade biológica da Cistatina-B da piranha vermelha Pygocentrus nattereri

RESUMO

A aquicultura é o setor de maior crescimento entre as indústrias de produção animal. Paralelo a esse importante crescimento ocorre o surgimento de doenças infecciosas, as quais podem causar significativas perdas nos estoques e problemas com o bem-estar animal, sendo o maior obstáculo para avanços na produção aquícola. Para enfrentar essa problemática é necessário associar boas técnicas de manejo ao desenvolvimento de novas tecnologias. Áreas como a biotecnologia e a engenharia genética possibilitam a produção de proteínas recombinantes, as quais podem ser utilizadas tanto na prevenção como no tratamento de doenças, sendo consideradas promissoras para o uso na indústria aquícola. Desta forma, fica evidente a necessidade de reunir toda informação referente ao estado da arte do uso de proteínas recombinantes na aquicultura. Assim, no primeiro capítulo dessa tese foi feita uma revisão do potencial terapêutico das proteínas imunorregulatórias na aquicultura, o que destaca que o uso de proteínas imunorregulatórias tem potencial para serem utilizadas na prevenção e tratamento de doenças de peixes. Dentre as proteínas que apresentam esse potencial, destaca-se as cistatinas. Desta forma, no segundo capítulo foi produzida uma Cistatina-B, oriunda da piranha vermelha Pygocentrus nattereri de forma heteróloga. As cistatinas são conhecidas por formar uma superfamília de inibidores de proteases de cisteína que apresentam um papel chave na degradação de proteínas e estão relacionadas a diferentes processos fisiológicos, como o desenvolvimento e imunidade. Para isso, juvenis de P. nattereri foram capturados no lago Janauacá, município de Manaquiri Amazonas, Brasil. Através da tecnologia do DNA recombinante a proteína Cistatina-B foi produzida e expressada na levedura Pichia pastoris. Foram avaliados a atividade biológica inibitória da protease de cisteína e ação bacteriostática nas bactérias Escherichia coli e Bacillus subtilis. A expressão e purificação da proteína imunorregulatória recombinante rCistatina-B revelou um fragmento de aproximadamente 11.8 kDa. A atividade inibitória atingiu 100% de inibição a uma concentração de 60 µg/µL resposta dependente-concentração do inibidor. Ação bacteriostática em E.coli e B. subtilis, numa concentração de 60 µg/µL de rCistatina-B, apresentou um halo de inibição de 9.66±0.55 mm e 10.50±2.54 mm, respectivamente, inferiores ao observado no controle positivo (espectinomicina) para as duas bactérias (23.93±1.42 e 21.39±1.83 mm) (P<0.05). Na concentração de 80 µg/µL a resposta foi similar, com valores de 8.83±0.72 mm para E.coli e 13.34±5.64 para B. subtilis, menores comparadas com o controle positivo (20±0.04 mm e 24.53±3.91) (P<0.05). Desta forma, o sistema de expressão eucarionte foi hábil em produzir a proteína recombinante rCistatina-B de Pygocentrus nattereri. A partir da confirmação do potencial biológico da Cistatina-B da piranha, análises in silico foram realizadas no genoma do peixe tambaqui Colossoma macropomum. Essas análises, que constituem o capítulo 3 dessa tese, permitiram identificar e analisar a Cistatina-B em todo o genoma do tambaqui. Foram identificados oito genes que codificam para a cistatina-B com base na sequência da piranha. Em geral, o tamanho das Cistatinas-B variaram de 96 a 101 aminoácidos, estão presentes majoritariamente no citoplasma, todas apresentaram motivos e domínios conservados nas cistatinas, além de apresentarem estrutura tridimensional similar a cistatina humana cristalografada. Como conclusão, o conhecimento e desenvolvimento das proteínas imunorregulatórias recombinantes e seu potencial terapêutico na aquicultura permite fornecer um novo bioproduto, o qual poderá ser usado como suplemento para estimulação do sistema imune em peixes.

ABSTRACT

Aquaculture is the fastest growing sector among animal production industries. Parallel to this important growth is the emergence of infectious diseases, which can cause significant losses in stocks and problems with animal welfare, being the biggest obstacle to advances in aquaculture production. To face this problem, it is necessary to associate good management techniques with the development of new technologies. Areas such as biotechnology and genetic engineering enable the production of recombinant proteins, which can be used both in the prevention and treatment of diseases, being considered promising for use in the aquaculture industry. Thus, it is evident the need to gather all information regarding the state of the art of the use of recombinant proteins in aquaculture. Thus, in the first chapter of this thesis, a review was made of the therapeutic potential of immunoregulatory proteins in aquaculture, which highlights that the use of immunoregulatory proteins has the potential to be used in the prevention and treatment of fish diseases. Among the proteins that have this potential, cystatins stand out. Thus, in the second chapter a Cystatin-B was produced, originating from the red piranha Pygocentrus nattereri in a heterologous way. Cystatins are known to form a superfamily of cysteine protease inhibitors that play a key role in protein degradation and are related to different physiological processes, such as development and immunity. For that, juveniles of P. nattereri were captured in the lake Janauacá, municipality of Manaquiri - Amazonas, Brazil. Through recombinant DNA technology, the protein Cystatin-B was produced and expressed in the yeast Pichia pastoris. The biological activity of cysteine protease and bacteriostatic action in Escherichia coli and Bacillus subtilis were evaluated. The expression and purification of the recombinant immunoregulatory protein rCystatin-B revealed a fragment of approximately 11.8 kDa. The inhibitory activity reached 100% inhibition at a concentration of 60 µg/µL response dependent on the concentration of the inhibitor. Bacteriostatic action in E.coli and B. subtilis, at a concentration of 60 µg /µL of rCystatin-B, showed an inhibition halo of 9.66 ± 0.55 mm and 10.50±2.54 mm, respectively, lower than that observed in the positive control (spectinomycin) for the two bacteria (23.93 ± 1.42 and 21.39 ± 1.83 mm) (P <0.05). At a concentration of 80 µg/µL the response was similar, with values of 8.83 ± 0.72 mm for E.coli and 13.34 ± 5.64 for B. subtilis, lower compared to the positive control (20 ± 0.04 mm and 24.53 ± 3.91) (P <0.05). Thus, the eukaryotic expression system was able to produce the recombinant protein rCystatin-B from Pygocentrus nattereri. From the confirmation of the biological potential of Cystatin-B of the piranha, in silico analyzes were carried out in the genome of the tambaqui fish Colossoma macropomum. These analyzes, which constitute chapter 3 of this thesis, made it possible to identify and analyze Cystatin-B throughout the tambaqui genome. Eight genes that code for Cystatin-B have been identified based on the piranha sequence. In general, the size of Cystatins-B varies from 96 to 101 amino acids, are present mainly in the cytoplasm, all of them presented motifs and domains conserved in cystatines, in addition to presenting a threedimensional structure similar to crystallized human cystatin. In conclusion, the knowledge and development of recombinant immunoregulatory proteins and their therapeutic potential in aquaculture allows us to provide a new bioproduct, which can be used as a supplement to stimulate the immune system in fish.