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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-219370

Resumo

A infecção pelo ectoparasito crustáceo Lernaea cyprinacea destaca-se pelo prejuízo econômico causado em pisciculturas catarinenses e brasileiras, ao inviabilizar a comercialização dos animais, uma vez que, ao fixar-se no peixe, provoca lesões severas em seu tegumento deixando-o com um aspecto repugnante. Uma das espécies-alvo deste crustáceo é o jundiá Rhamdia quelen, que vem atraindo a atenção dos produtores de Santa Catarina por conta da facilidade com que se reproduz em cativeiro, boa conversão alimentar e a positiva aceitação dessa espécie pelo mercado consumidor. Apesar disso, o sucesso da criação de peixes é resultado direto de uma série de fatores que estão estreitamente ligados ao seu bem-estar. Tais fatores, quando não acompanhados e controlados, podem gerar situações de estresse ao ponto de reduzir o desempenho zootécnico dos animais e predispô-los ao aparecimento de enfermidades oportunistas. Ainda que pertença a um grupo tão patogênico, é notória a falta de estudos que detalham características básicas e específicas relacionadas aos diferentes aspectos do parasitismo por L. cyprinacea, além de avaliações que investiguem o potencial de tratamentos alternativos frente a essa enfermidade. Sendo assim, treze jundiás R. quelen reprodutores intensamente parasitados por L. cypriancea com prevalência de 100%, intensidade média de 192,38 e abundância média de 192,38 foram coletados da Unidade de Melhoramento Genético de Peixes (Epagri/Cedap - Camboriú) e transportados até o Laboratório AQUOS (Florianópolis/SC). Após o período de aclimatação, os animais foram anestesiados com Eugenol (75 mg L-1). O sangue coletado por punção do vaso caudal para contagem de trombócitos, leucócitos totais, diferencial de leucócitos e quantificação de eritrócitos totais. Em seguida, os animais foram eutanasiados, os parasitos removidos, quantificados e fixados de acordo com o tipo de análise, e as porções do tegumento atingidas fixadas em formalina 10% tamponada. Realizou-se microscopia eletrônica de varredura (SEM) dos parasitos, microscopia de contraste de fases (DIC) e amplificação em PCR dos espécimes. Finalmente, para avaliação dos tratamentos alternativos, foram utilizados, separadamente, por Concentração Inibitória Mediana (CIM in vitro), os óleos nanoemulsionados da acícula e da resina do pinheiro Pinus sp., além do produto comercial biodegradável à base de biomassa crítica Biogermex®. Foram avaliadas as mortalidades das duas fases larvais de L. cyprinacea (náuplio e copepodito) para cada composto testado. Com base nos melhores resultados para cada fase larvar, seguiu-se para o teste in vivo (CL50 96 h) utilizando alevinos de jundiá R. quelen (1,13 ± 0,33 g de peso e 5,07 ± 0,63 cm de comprimento). O perfil hematológico dos animais se mostrou diferente do reportado para animais saudáveis. Os valores de leucócitos totais mostraram correlação significativa (p<0,05) e positiva com a intensidade parasitária e o peso dos animais. A quantidade de neutrófilos e trombócitos circulantes no sangue mantiveram-se abaixo do normal, caracterizando um cenário de neutropenia e trombocitopenia, respectivamente. Mais ainda, a quantidade de leucócitos imaturos registrada mostrou-se muito acima do normal registrado para R. quelen adultos de mesma idade. Desta forma, é possível perceber a rápida produção de leucócitos pelos órgãos hematopoiéticos ao tentar combater o forte parasitismo provocado pela L. cyprinacea. Em análise histológica do tecido do animal, foi possível observar o acúmulo de neutrófilos próximo ao local de infecção pelo parasito, concordando com a ausência deste tipo celular no fluxo sanguíneo dos peixes analisados. As alterações de grau leve relatadas foram infiltrado eosinofílico, alargamento dos tecidos subcutâneo e conjuntivo, atrofia da fibra muscular, perda do tecido muscular, necrose do tecido conjuntivo, necrose liquefativa, fibrose, hemorragia, congestão, hipertrofia e hiperplasia das células de muco, alargamento e erosão do tecido epitelial, redução da espessura da epiderme e perda de células de muco. Em grau moderado, pôde-se observar inflamação mono e polimorfonuclear, infiltrado leucocitário, extravasamento de sangue e desarranjo do tecido conjuntivo, necrose epitelial e hipertrofia das células de alarme. Já em grau severo foi relatado hiperplasia das células de alarme, ou seja, o aumento na quantidade deste tipo celular. As sequencias parciais do RNA ribossomal 18S e da região hipervariável D1-D2 do RNA ribossomal 28S foram amplificadas por PCR, sendo os iniciadores específicos de L. cyprinacea, capazes de produzir amplicons com o tamanho esperado para ambos os genes ( 1460 e 690 pares de base para 18S e 28S, respectivamente). Tal resultado concorda com trabalhos anteriores e estão em conformidade com as características morfológicas encontradas nos espécimes analisados em SEM e DIC. Os óleos nanoemulsionados da acícula e da resina de Pinus sp. foram capazes de inibir náuplios de L. cyprinacea em concentrações que variaram de 10 a 19,5 mg L-1. Apesar da pequena faixa de variação entre eles, o óleo da resina demonstrou maior consistência ao manter-se estável durante as 24 h do início dos testes. O melhor resultado para copepoditos, no entanto, veio do Biogermex®, o qual inibiu a segunda fase larvar de L. cyprinacea em uma faixa que variou entre 30,5 e 244 mg L-1, de acordo com o tempo de análise. O composto majoritário dos óleos (-Pineno), assim como os demais controles testados, não apresentaram eficácia individualmente para eliminar as larvas de L. cyprinacea em baixas concentrações, sugerindo que o sinergismo entre o -Pineno e os demais compostos foram os reais causadores dos efeitos adversos sobre as larvas do parasito. Em ensaio in vivo, a análise dos dados segundo o método estatístico utilizado indicou a concentração de 12,75 e 16,74 mg L-1 como a CL50 96 h do Biogermex® e da acícula de Pinus sp., respectivamente, em alevinos de jundiá. Tal resultado indica um potencial de uso da nanoemulsão do óleo da acícula de Pinus sp. como agente profiláticos contra náuplios de L. cyprinacea

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The infection caused by the crustacean ectoparasite Lernaea cyprinacea stands out because the economic losses inflicted in Santa Catarina and Brazilian fish farms, as it makes the commercialization of the animals unfeasible, since, by fixing on the fish, it causes severe lesions in its integument, leaving it with a repulsive aspect. One of the target species of this crustacean is the silver catfish Rhamdia quelen, which has drawning attention of producers in Santa Catarina due to the ease with which it breeds in captivity, the good feed conversion and the positive acceptance of this species by the consumer. Despite this, the success of fish farming is a direct result of a number of factors that are closely linked to the well-being of the animals. Such factors, when not monitored and controlled, can generate stressful situations to the point of reducing the animals' zootechnical performance and predisposing them to the appearance of opportunistic diseases. Even though it belongs to such a pathogenic group, there is a notable lack of studies that detail basic and specific characteristics related to different aspects of parasitism by L. cyprinacea, in addition to evaluations that investigate the potential of alternative treatments against this disease. Thus, thirteen R. quelen breeders intensely parasitized by L. cypriancea with a prevalence of 100%, mean intensity of infection of 192.38 and mean abundance of infection of 192.38 were collected from the Fish Genetic Improvement Unit (Epagri/Cedap - Camboriú) and transported to AQUOS - Health of Aquatic Organisms Laboratory (Florianópolis/SC). After the animals acclimation, they were anesthetized with Eugenol (75 mg L-1) and the blood collected by puncturing of the caudal vessel for indirect quantification of the thrombocytes and total leukocytes, direct assessment of the differential leukocyte count and quantification of total erythrocytes. After this, the animals were euthanized, the parasites removed, quantified and fixed according to the type of analysis, and the portions of the integument affected by the crustacean fixed in 10% buffered formalin. Scanning Electron Microscopy (SEM), Differential Interference Contrast (DIC) microscopy and PCR amplification of the specimens were performed. Finally, for the evaluation of alternative treatments, the nanoemulsified oils of the acule and resin of Pinus sp., in addition to the biodegradable commercial product based on citrical biomass Biogermex®, were used separately to assess the Minimum Inhibitory Concentration (in vitro). The mortalities of the two larval phases of L. cyprinacea (nauplii and copepodite) for each tested compound were evaluated. Based on the best results for each larval phase, the in vivo test (CL50 96 h) was followed using the fry stage of silver catfish R. quelen (1,13 ± 0,33 g of weight and 5,07 ± 0,63 cm of length). The hematological profile of the animals was different from that reported for healthy individuals. The total leukocyte values showed a significant (p <0.05) and positive correlation with the intensity of infection and the animals weight. The number of neutrophils and thrombocytes circulating in the blood remained below normal, characterizing a scenario of neutropenia and thrombocytopenia, respectively. Furthermore, the amount of immature leukocytes recorded was much higher than the normal recorded for R. quelen adults of the same age. Therefore, it is possible to see the rapid production of leukocytes by the hematopoietic organs when trying to combat the strong parasitism caused by L. cyprinacea. In histological analysis of the animal's tissue, it was possible to observe the accumulation of neutrophils close to the infection site by the parasite, a scenario that agreeds with the fact that this cell type was almost absent in the blood flow of the analyzed fish. The mild changes reported were eosinophilic infiltration, enlargement of the subcutaneous and connective tissues, muscle fiber atrophy, loss of muscle tissue, connective tissue necrosis, liquefactive necrosis, fibrosis, hemorrhage, congestion, hypertrophy and hyperplasia of goblet cells, enlargement and erosion of epithelial tissue, reduction of epithelium thickness and loss of goblet cells. At a moderate degree a mono- and polymorphonuclear inflammation, leukocyte infiltration, blood extravasation, connective tissue disorganization, epithelial necrosis, hemorrhage and hypertrophy of the alarm cells (claviform cells) were noted. Finnaly, in severe degree, hyperplasia of alarm cells has been reported, i.e. the increase in the amount of this cell type. The partial sequences of the ribosomal RNA 18S and the hypervariable region D1-D2 of the ribosomal RNA 28S were amplified by PCR, being the specific primers of L. cyprinacea capable of producing amplicons of the expected size for both genes ( 1460 and 690 bp for 18S and 28S, respectively). This result agrees with previous works and is in accordance with the morphological characteristics found in the specimens analyzed in SEM and DIC. The nanoemulsified oils from the Pinus sp. were able to inhibit L. cyprinacea nauplii in concentrations ranging from 10 to 19.5 mg L-1. Despite the small range of variation between them, the resin oil showed greater consistency, remaining stable during the 24 h after the beginning of the tests. The best result for copepodites, however, came from Biogermex®, which inhibited the second larval phase of L. cyprinacea in a range that varied between 30.5 and 244 mg L-1, according to the time of analysis. The major compound of the oils' (-Pinene), as well as the other tested controls, did not shown individual effectiveness to eliminate the larvae of L. cyprinacea in low concentrations, suggesting that the synergism between -Pinene and the other compounds were the real ones causing the adverse effects on the parasite larvae. In the in vivo test, data analysis according to the statistical method used indicated the concentration of 12.75 and 16.74 mg L-1 as the CL50 96 h of Biogermex® and Pinus sp., respectively, for silver catfish fries. Such result indicates a potential use of the nanoemulsion of Pinus sp. as a prophylactic agent against L. cyprinacea nauplii.

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