Desenvolvimento de ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção da proteína C reativa canina com uso de proteína recombinante

RESUMO

No cão, a proteína C reativa (PCR) é a proteína de fase aguda de maior destaque, com a capacidade de apresentar valores basais baixos em animais saudáveis e nas comorbidades podem sofrer elevação alcançando pico em 24 a 48 horas após o insulto, normalizando em 2 a 3 semanas após a recuperação. O termo proteína C reativa foi dado em 1930 pela capacidade de precipitar polissacarídeo C de S. pneumoniae, já o isolamento e caracterização da PCR canina se deu em 1984. Uma vez que o estudo da PCR canina tem tido muito destaque em diversas enfermidades inflamatórias. O objetivo deste trabalho foi expressar a proteína recombinante (PCR_dog vetor PET 14b) através de extratos de Escherichia coli - Rosetta (DE3) - plasmídeo pRARE e desenvolver o ensaio imunoenzimático (ELISA) no formato sanduíche para monitoramento de quadros inflamatórios em cães. A expressão foi controlada com a técnica do SDS-PAGE e espectrometria de massa onde foi observado uma proteína com peso de 25 kDa correspondente ao peso da PCR canina e a confirmação com caracterização estrutural respectivamente; o Western Blot verificou a reatividade contra a PCR canina. O ensaio ELISA piloto foi executado com 6 amostras de soro de cães, sendo duas amostras como controle (animais hígidos) e quatro como testes (animais enfermos). Para diluição e padronização da curva, foi utilizada a proteína recombinante PCR_dog vetor pET 14b expressa em cepas de bactérias Escherichia coli - Rosetta (DE3) - plasmídeo pRARE. Também, para produção de IgGs, coelhos e camundongos foram imunizados com a PCR_dog vetor PET 14b expressa, e para a verificação do reconhecimento dos anticorpos contra a proteína de fase aguda biológica, o Western Blot foi feito. Os resultados apresentados neste trabalho são promissores e para o futuro, a utilização das proteínas de fase aguda pode ser considerada uma das ferramentas laboratoriais mais promissoras na medicina veterinária, porém são necessárias melhorias no sistema de expressão e o aperfeiçoamento do ensaio ELISA para futura validação à campo.

ABSTRACT

In dogs, C-reactive protein (CRP) is the major acute-phase protein, with the ability to present decreased values in healthy animals and in comorbidities they may increase, reaching a peak within 24 to 48 hours after the insult, normalizing in 2 to 3 weeks after recovery. The term C-reactive protein was given by the ability to precipitate polysaccharide C from S. pneumoniae in 1930, whereas the isolation and characterization of canine CRP took place in 1984. Since, the study of canine CRP has been very prominent in several inflammatory diseases . The objective of this work was to express the recombinant protein (CRP_dog vector PET 14b) through extracts of Escherichia coli - Rosetta (DE3) - plasmid pRARE and carry out the procedures for the development of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) sandwich format for monitoring inflammatory conditions in dogs. The expression was controlled with the technique of SDS-PAGE and mass spectrometry, where a protein with a weight of 25 kDa corresponding to the weight of the canine CRP was observed and confirmation with structural characterization, respectively; Western Blotting verified reactivity against canine CRP. The pilot ELISA assay was performed with 6 samples of serum from dogs, two samples as controls (healthy animals) and four as tests (sick animals). For dilution and standardization of the curve, the recombinant protein CRP_dog vector pET 14b expressed in bacterial strains Escherichia coli - Rosetta (DE3) - plasmid pRARE was used. Also, for the production of IgGs, rabbits and mice were immunized with the CRP_dog vector PET 14b expressed, and to verify the recognition of antibodies against the biological acute phase protein, Western Blotting was performed. The results presented in this work are promising and for the future, the use of acute phase proteins can be considered one of the most promising laboratory tools in veterinary medicine, but it is necessary to improve the expression system and improve the ELISA assay for future validation of field.