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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-219694

Resumo

A biodiversidade animal vem diminuindo como reflexo da excessiva exploração dos recursos naturais. Dentre esses animais, os cervídeos apresentam um número considerável de espécies inclusas, sendo o veado-catingueiro (Mazama gouazoubira) uma espécie vulnerável. Como instrumento para conservar espécies ameaçadas, é possível utilizar as biotécnicas reprodutivas, como a transferência nuclear de células somáticas interespecífica (TNCSi). Portanto, esse trabalho teve como objetivo comparar a expressão gênica de embriões clones intraespecíficos (bovino-bovino), interespecíficos (cervídeo-bovino) e embriões bovinos oriundos de fecundação in vitro (FIV). O cultivo celular (fibroblasto) foi realizado de 7-14 dias a partir de amostras criopreservadas de pele de veado-catingueiro e de bovino já existentes no laboratório. Posteriormente, oócitos bovinos foram maturados, desnudados, e utilizados na reconstrução embrionária nos grupos (citoplasto/carioplasto): cervídeo/bovino e bovino/bovino e posteriormente ativados. Os embriões reconstruídos juntamente com os oriundos de FIV, utilizados como grupo controle, foram mantidos a -80º C até avaliação da expressão gênica. Os genes OCT4, T-FAM, GJA1, BAX e BCL2, relacionados à qualidade embrionária, foram análisados por PCR em tempo real tendo como referência os genes, GAPDH, B-ACTINA e 16S. Para análise estatística, a quantificação relativa da expressão dos genes foi realizada utilizando o método 2-Ct. Os perfis de expressão foram apresentados como média (± desvio padrão) da quantificação relativa de mRNA e avaliados pelo teste de Kruskal-Wallis ou Mann-Whitney, quando conveniente, considerando um nível de significância de 5%. Não houve diferença (p > 0,05) no desenvolvimento embrionário entre intraTNCS e interTNCS (72,8% e 65,5% de taxa de clivagem, 38,7% e 43,2% de taxa de mórula e 11,3% e 5,9% de taxa de blastocistos, respectivamente). Ao analisar a expressão do gene OCT4, observou-se diferença (p < 0,05) nos grupos intraTNCS e inter TNCS quando comparados com o grupo FIV. A expressão do T-FAM no grupo intraTNCS obteve uma expressão significativamente maior quando comparado com o grupo FIV (p <0,05). No entanto, essa diferença não foi observada entre os grupos FIV e interTNCS, assim como os grupos intraTNCS e interTNCS (p >0,05). A expressão do gene GJA1 foi estatisticamente semelhante (p > 0,05) em todos os grupos experimentais. O gene BAX obteve uma expressão estatisticamente diferente entre todos os grupos, sendo mais expresso no grupo intraTNCS (p <0,05). Por sua vez, o gene BCL2 obteve uma expressão próxima de valores nulos em todos os grupos. A partir dos resultados obtidos conclui-se que a diferença observada na expressão de alguns genes nos embriões cervídeo-bovino não interferiu no desenvolvimento, sendo possível afirmar que os citoplastos bovinos são capazes de reprogramar os carioplastos do veado-catingueiro. Cabe frisar que, apesar dessa reprogramação é interessante a realização de estudos que avaliem a reprogramação epigenética nesses embriões. Essa pesquisa ajudará a elucidar os mecanismos envolvidos na interação núcleo-citoplasma e que resultam na ativação ou inativação de genes importantes para o desenvolvimento embrionário e formação de indivíduos.

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Animal biodiversity has been decreasing as a result of the excessive exploitation of natural resources. Among these animals, deer have a considerable number of included species, and the brocket deer (Mazama gouazoubira) is a vulnerable species. As a tool to conserve endangered species, it is possible to use reproductive biotechniques, such as interspecific somatic cell nuclear transfer (iSCNT). Therefore, this work aimed to compare the gene expression of clone embryos obtained by intraspecific (bovine- bovine), interspecific (cervid- bovine) and bovine embryos from in vitro fertilization (IVF). Cell culture (fibroblast) was carried out for 7-14 days from cryopreserved samples of brocket deer and bovine skin already existing in the laboratory. Later, bovine oocytes were matured, denuded, and used in embryonic reconstruction in the groups (cytoplast/karyoplast): cervid/bovine and bovine/bovine and later activated. Embryos reconstructed together with those from IVF, used as a control group, were kept at -80º C until evaluation of gene expression. The OCT4, T-FAM, GJA1, BAX and BCL2 genes, related to embryo quality, were analyzed by real-time PCR having as reference the genes, GAPDH, B-ACTIN and 16S. For statistical analysis, the relative quantification of gene expression was performed using the 2-Ct method. Expression profiles were presented as mean (± standard deviation) of the relative quantification of mRNA and evaluated by the Kruskal-Wallis or Mann-Whitney test, when convenient, considering a significance level of 5%. There was no difference (p > 0.05) in embryonic development between intraSCNT and interSCNT (72.8% and 65.5% cleavage rate, 38.7% and 43.2% morula rate and 11.3% and 5.9% blastocyst rate, respectively). When analyzing the expression of the OCT4 gene, a difference (p < 0.05) was observed in the intraSCNT and interSCNT groups when compared to the IVF group. The expression of T-FAM in the intraSCNT group had a significantly higher expression when compared to the IVF group (p < 0.05). However, this difference was not observed between the IVF and interSCNT groups, as well as the intraSCNT and interSCNT groups (p >0.05). GJA1 gene expression was statistically similar (p > 0.05) in all experimental groups. The BAX gene had a statistically different expression between all groups, being more expressed in the intraSCNT group (p < 0.05). In turn, the BCL2 gene had an expression close to null values in all groups. From the results obtained, it can be concluded that the difference observed in the expression of some genes in the cervid-bovine embryos did not interfere in the development, being possible to affirm that the bovine cytoplasts are capable of reprogramming the brocket deer karyoplasts. It should be noted that, despite this reprogramming, it is interesting to carry out studies that assess the epigenetic reprogramming in these embryos. This research will help to elucidate the mechanisms involved in the nuclear-cytoplasm interaction and that result in the activation or inactivation of genes important for embryonic development and formation of individuals.

Biblioteca responsável: BR68.1