GENÔMICA COMPARATIVA DE STAPHYLOCOCCUS SPP. ASSOCIADOS À MASTITE SUBCLÍNICA CAPRINA NA PARAÍBA

RESUMO

Infecções intramamárias acometem frequentemente os animais leiteiros, gerando danos tanto na saúde dos animais e perdas significativas na quantidade e qualidade do leite produzido, como riscos para a saúde dos consumidores tendo em vista que as glândulas mamárias infectadas podem abrigar micro-organismos potencialmente zoonóticos. Os Staphylococcus frequentemente são detectados em exame microbiológico no leite de animais acometidos por infecção mamária. Sendo assim, faz-se necessário estudos mais aprofundados relacionados à resistência antimicrobiana e os fatores de virulência, além de elementos genéticos móveis, afim de minimizar as perdas para a cadeia produtiva e para a saúde pública. O sequenciamento do genoma completo é uma ferramenta desenvolvida para auxiliar com maior facilidade, rapidez e menores custos toda a epidemiologia genômica dos micro-organismos, e, através da anotação funcional, realizar comparações entre micro-organismos e identificar diferenças e similaridades entre elas. O capítulo I, é um referencial teórico, que demonstra aspectos da qualidade do leite de cabras, tanto nos aspectos físico-químicos como microbiológicos, com base na legislação nacional vigente e suas implicações na produção e saúde dos animais e seres humanos. Os capítulos II, III e IV avaliam através do sequenciamento dos genomas, genes de resistência, detecção de plasmídeos, e fatores de virulência de três espécies de Staphylococcus (S.) (S. caprae, S. epidermidis e S. aureus) originários de leite de cabras. As amostras foram submetidas ao teste fenotípico de difusão em discos. Após extração do DNA genômico total e posterior avaliação quali-quantitativa do DNA, foram sequenciadas em tecnologia Illumina Miseq. A montagem de todos os genomas foi executada em Unicycler. A anotação das amostras de S. caprae foi avaliada por meio de análise do pan-genoma. Foi verificada a presença de genes de resistência a tetraciclina, -lactâmicos, fosfomicina, macrolídeos, fenicóis e quinolonas. Já para os fatores de virulência, foram observados aderência, exoenzimas, evasão imune, absorção e metabolism do ferro e toxinas. Os capítulos III e IV, analisam respectivamente as amostras de S. epidermidis e S. aureus a despeito do tipo de sequência multilocus (ST), predição de genes de virulência, plasmídeos rep, tipo de cassete cromossomal e fatores de virulência. Uma amostra de cada uma dessas espécies, detectou o gene mec e tipo de SCCmecIV. S epidermidis exibiu três tipos de sequência multilocus diferentes, resistência genotípica as classes dos macrolídeos, -lactâmicos, tetraciclinas, aminoglicosídeos e fosfomicina e seis diferentes plasmídeos, além de fatores de virulência a aderência, enzimas, evasão imune, toxinas e sistema de secreção. Nas cepas de S. aureus, adicionalmente, foram realizadas análises da proteína A e filogenia. As amostras pertenciam a quatro STs e cinco proteínas A (spa) diferentes. Houve maior prevalência de resistência para os genes de tetraciclina e beta-lactâmicos, entretanto, uma cepa ainda apresentou genes de resistência a trimetropim, macrolídeos, aminogligosídeo e fenicol. Os genes de virulência foram classificados em exoenzimas, toxigênicos e resposta imune. Em resumo, a ocorrência de genes de resistência e plasmídeos portadores de genes de resistência, inclusive, para antimicrobianos de último recurso em infecções humanas mais graves, além de grande frequência de genes de virulência em isolados de Staphylococcus spp. de originários de leite de cabras reforça a preocupação frente à qualidade do leite produzido como alimento seguro.

ABSTRACT

Intramammary infections often affect dairy animals, causing damage to the health of animals and significant losses in the quantity and quality of milk produced, as well as risks to the health of consumers, given that infected mammary glands can harbor potentially zoonotic microorganisms. Staphylococcus are frequently detected in microbiological examination in the milk of animals affected by mammary infection. Therefore, further studies related to antimicrobial resistance and virulence factors, in addition to mobile genetic elements, are necessary in order to minimize losses to the production chain and public health. The whole genome sequencing is a tool developed to assist with greater ease, speed and lower costs the entire genomic epidemiology of microorganisms, and, through functional annotation, perform comparisons between microorganisms and identify differences and similarities between them. Chapter I is a theoretical framework that demonstrates aspects of goat milk quality, both in physical-chemical and microbiological aspects, based on current national legislation and its implications for the production and health of animals and human beings. Chapters II, III and IV evaluate through genome sequencing, resistance genes, plasmid detection, and virulence factors of three species of Staphylococcus (S.) (S. caprae, S. epidermidis and S. aureus) originating from goats milk. The samples were submitted to the disc diffusion phenotypic test. After extraction of the total genomic DNA and subsequent quali-quantitative evaluation of the DNA, they were sequenced using Illumina Miseq technology. Assembly of all genomes was performed in Unicycler. The annotation of S. caprae samples was evaluated by pan-genome analysis. The presence of resistance genes to tetracycline, -lactams, fosfomycin, macrolides, phenicols and quinolones was verified. As for virulence factors, adherence, exoenzymes, immune evasion, absorption and metabolism of iron and toxins were observed. Chapters III and IV, respectively, analyze S. epidermidis and S. aureus samples regardless of the multilocus sequence type (ST), virulence gene prediction, rep plasmids, chromosomal cassette type and virulence factors. A sample of each of these species detected the mec gene and type of SCCmecIV. S. epidermidis exhibited three different multilocus sequence types, genotypic resistance to macrolides, -lactams, tetracyclines, minoglycosides and fosfomycin and six different plasmids, in addition to adherence virulence factors, enzymes, immune evasion, toxins and secretion system. In the S. aureus strains, additionally, analyzes of protein A and phylogeny were performed. The samples belonged to four different ST's and five different A (spa) proteins. There was a higher prevalence of resistance for the tetracycline and beta-lactam genes, however, one strain still showed resistance genes to trimethoprim, macrolides, aminoglycoside and phenicol. Virulence genes were classified into exoenzymes, toxigenics and immune response. In summary, the occurrence of resistance genes and plasmids carrying resistance genes, including for antimicrobials of last resort in more severe human infections, in addition to the high frequency of virulence genes in Staphylococcus spp. from goats' milk reinforces the concern about the quality of the milk produced as a safe food.