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MOLECULAR DETECTION AND GENETIC DIVERSITY OF ARTHROPOD AND TREMATODE-BORNE AGENTS IN NON-HEMATOPHAGOUS BATS FROM MIDWESTERN BRAZIL

PRISCILA IKEDA.
Tese em Inglês | VETTESES | ID: vtt-220226

Resumo

Estima-se que 75% das doenças emergentes compreendam zoonoses, cuja maioria tem como fontes de infecção animais selvagens; destas, cerca de 22,8% são veiculadas por vetores artrópodes. Desta forma, monitorar a presença de patógenos em animais selvagens em nichos compartilhados com seres humanos se torna um importante método preventivo de infecções zoonóticas. As famílias Bartonellaceae e Anaplasmataceae englobam Alphaproteobactérias Gram-negativas, intracelulares facultativas e obrigatórias, respectivamente, que vêm sendo identificadas em uma ampla variedade de mamíferos, incluindo seres humanos. Já os micoplasmas hemotróficos são bactérias Gram-negativas sem parede celular, de localização epieritrocitária, que podem causar desde infecções assintomáticas até anemia hemolítica severa, tanto em animais como em humanos. Coxiella burnetii é o principal representante da família Coxiellaceae (Gammaproteobactérias) e é conhecida por causar a Febre Q em humanos. Apesar de ser transmitido por aerossóis, esse agente vem sendo detectado em diversos ectoparasitos que talvez possam atuar em seu ciclo de vida. Já os piroplasmas são protozoários da ordem Piroplasmida e causam principalmente anemia hemolítica em animais de produção, domésticos e, eventualmente, em seres humanos. Embora esses agentes supracitados vêm sendo cada vez mais estudados em quirópteros, ainda pouco se sabe a respeito de sua ocorrência e diversidade genética em morcegos no Brasil. Os principais ectoparasitos encontrados nesses animais são representados por moscas das famílias Streblidae e Nycteribiidae, carrapatos, e ácaros das famílias Spinturnicidae e Macronyssidae. Considerando os patógenos de interesse em Saúde Pública supracitados e a expressiva representatividade de animais da ordem Chiroptera no Brasil, objetivou-se obter informações sobre a ocorrência e diversidade genética de agentes Anaplasmataceae, Bartonellaceae, Mycoplasmataceae, Coxiellaceae e protozoários da ordem Piroplasmida em quirópteros e seus respectivos ectoparasitos coletados em área periurbana da cidade de Campo Grande, estado do Mato Grosso do Sul, no centro-oeste brasileiro. Um total de 418 amostras (135 amostras de baço, 133 de sangue e 150 ectoparasitos) foram coletados de 135 animais das famílias Phyllostomidae, Vespertillionidae e Mollossidae. Por meio de técnicas moleculares verificou-se positividade de 18,13% (34/418) para Bartonella spp. dentre todas as amostras coletadas. Dessas, 17 amostras foram clonadas para o gene gltA a fim de obter 3 clones de cada uma para acessar a diversidade genotípica dentro da mesma amostra biológica. Com os 51 gltA-clones obtidos foi possível observar 13 genótipos diferentes, sendo que pelo menos dois ocorreram dentro de uma mesma amostra. Análises filogenéticas baseadas nos genes ftsZ, rpoB e nuoG confirmaram a alta diversidade de genótipos de Bartonella spp. em quirópteros e seus ectoparasitos. Para agentes Anaplasmataceae, foi observada positividade de 1,67% (7/418), 11,96% (50/418) e 13,63% (57/418) das amostras testadas para Anaplasma spp. (16S rRNA), Ehrlichia spp. (dsb) e Neorickettsia spp. (16S rRNA), respectivamente. As sequências obtidas mostraram-se similares a Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia minasensis, Neorickettsia risticii, e Neorickettsia findlayensis por análise iv pelo nBLAST, e filogeneticamente relacionado a Ehrlichia ruminantium baseado no gene gltA. Trata-se da primeira evidência molecular de agentes Anaplasmataceae em quirópteros e ectoparasitos associados no Brasil. Já para hemoplasmas, positividade de 13,6% (57/418) foi observada. Dentre as 24 sequências obtidas pelo gene 16S rRNA foi possível encontrar 12 genótipos diferentes que se distribuíram pelo macroclado do grupo haemofelis. As duas sequências 23S rRNA obtidas se posicionaram próximas a Candidatus Mycoplasma haematohydrochaerus, M. haemofelis e M. haemocanis. Todas as amostras de sangue e baço dos morcegos amostrados mostraram-se negativas na qPCR para C. burnetii baseada no gene IS1111. Para piroplasmídeos, 17 dos 135 (12,6%) morcegos amostrados mostraram-se positivos para agentes da ordem Piroplasmida (gene 18S rRNA). Trata-se do primeiro relato molecular de piroplasmídeos em quirópteros no Brasil. A análise filogenética mostrou a possível ocorrência de duas novas espécies: Piroplasmid n. sp. Artibeus spp., posicionado filogeneticamente próximo a Babesia canis e B. vogeli, e Piroplasmid n. sp. P. discolor, que formou um clado monofilético. Infelizmente, as amostras de ectoparasitos não puderam ser utilizadas na detecção de piroplasmídeos e C. burnetii. Enquanto moscas Streblidae mostraram positividade nos ensaios moleculares para Bartonella spp. (11/64), Ehrlichia spp. (7/64) e Mycoplasma spp. (1/64), carrapatos Ornithodoros hasei mostraram-se positivos para Ehrlichia spp. (3/19), Anaplasma spp. (1/19) e Neorickettsia spp. (1/19); por fim, ácaros Spinturniciidae e Macronyssidae apresentaram positividade para Bartonella spp. (4/21 Macronyssidae) e Ehrlichia spp. (18/21 Macronyssidae e 6/46 Spinturnicidae). Ainda, co-positividade para os diversos agentes pesquisados foi observada no presente estudo. Como conclusão, morcegos não-hematófagos de área periurbana do centro-oeste brasileiro atuam como hospedeiros para diversos genótipos de Bartonella spp. e hemoplasmas, para Ehrlichia spp. filogeneticamente associadas a E. ruminantium e para duas possíveis novas espécies de piroplasmídeos.
It is estimated that 75% of emerging diseases comprise zoonoses, most of which have wild animals as sources of infection; of these, about 22.8% are carried by arthropod vectors. Thus, monitoring the presence of pathogens in wild animals in niches shared with humans becomes an important preventive method for zoonotic infections. Bartonellaceae and Anaplasmataceae families comprise Gram-negative, facultative and obligate intracellular Alphaproteobacteria, respectively, that have been identified in a wide variety of mammals, including humans. On the other hand, hemotrophic mycoplasmas are epierythrocytic Gram-negative bacteria lacking cell wall, which can cause from asymptomatic infections to severe hemolytic anemia, both in animals and in humans. Coxiella burnetii is the main representative of the Coxiellaceae family (Gammaproteobacteria) and is known to cause Q fever in humans. Despite being transmitted by aerosols, this agent has been detected in several ectoparasites that may act in its life cycle. Piroplasmids, on the other hand, are protozoa of the order Piroplasmida, which can cause hemolytic anemia in farm and domestic animals and, occasionally, in humans. Although the abovementioned agents have been increasingly studied in bats, little is known about their occurrence and genetic diversity in bats from Brazil. The main ectoparasites found in these animals are Streblidae and Nycteribiidae flies, soft ticks, and Spinturnicidae and Macronyssidae mites. Considering the abovementioned pathogens of interest in Public Health and the expressive representation of animals of the order Chiroptera in Brazil, this study aimed to investigate the occurrence and genetic diversity of Anaplasmataceae, Bartonellaceae, Mycoplasmataceae, Coxiellaceae agents and protozoa of the order Piroplasmida in chiropterans and their respective ectoparasites collected in a periurban area of the city of Campo Grande, state of Mato Grosso do Sul, in central-western Brazil. A total of 418 samples (135 spleen, 133 blood and 150 ectoparasites) were collected from 135 animals of the Phyllostomidae, Vespertillionidae and Mollossidae families. Based on molecular assays, positivity of 18.13% (34/418) for Bartonella spp. was found among all collected samples. Out of these, 17 samples had their amplified Bartonella gltA amplicons cloned in order to obtain 3 clones of each one aiming at assessing the genotypic diversity within the same sample. Among the 51 Bartonella gltA-clones obtained, 13 different genotypes were found, with at least two occurring within individual samples. Phylogenetic analyses based on the ftsZ, rpoB and nuoG genes confirmed the high genotype diversity of Bartonella spp. in bats and their ectoparasites. For Anaplasmataceae agents, positivity of 1.67% (7/418), 11.96% (50/418) and 13.63% (57/418) was observed for Anaplasma spp. (16S rRNA), Ehrlichia spp. (dsb) and Neorickettsia spp. (16S rRNA), respectively. The sequences obtained were closely related to Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia minasensis, Neorickettsia risticii, and Neorickettsia findlayensis by BLASTn analyses, and phylogenetically related to Ehrlichia ruminantium based on gltA gene. This is the first molecular evidence of Anaplasmataceae agents in bats and associated ectoparasites from Brazil. Positivity of 13.6% (57/418) for hemoplasmas was found. Among the 24 sequences obtained by the 16S rRNA gene, it was possible to find 12 different vi hemoplasma genotypes that were distributed into Haemofelis group. The two obtained 23S rRNA hemoplasma sequences were closely related to Candidatus Mycoplasma haematohydrochaerus, M. haemofelis and M. haemocanis. All bats blood and spleen samples were negative in the qPCR for C. burnetii based on the IS1111 gene. Seventeen of the 135 (12.6%) bats were positive for Piroplasmida (18S rRNA gene). This is the first molecular report of piroplasmids in bats from Brazil. Phylogenetic analysis showed the possible occurrence of two new species: Piroplasmid n. sp. Artibeus spp., which was closely related to Babesia canis and B. vogeli, and Piroplasmid n. sp. P. discolor, which formed a monophyletic clade. Unfortunately, the ectoparasite samples could not be used in the PCR assays for piroplasmids and C. burnetii. While Streblidae flies showed positivity in molecular assays for Bartonella spp. (11/64), Ehrlichia spp. (7/64) and Mycoplasma spp. (1/64), Ornithodoros hasei ticks were positive for Ehrlichia spp. (3/19), Anaplasma spp. (1/19) and Neorickettsia spp. (1/19). Spinturnicidae and Macronyssidae mites were positive for Bartonella spp. (4/21 Macronyssidae) and Ehrlichia spp. (18/21 Macronyssidae and 6/46 Spinturnicidae). Also, co-positivity for the different agents studied was observed. In conclusion, non-hematophagous bats from a periurban area of central-western Brazil act as hosts for several genotypes of Bartonella spp. and hemoplasms, Ehrlichia spp. closely related to E. ruminantium, and for two possible new species of piroplasmids.
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