AVALIAÇÃO DA BIOLOGIA REPRODUTIVA E HISTOPATOLOGIA DOS OVÁRIOS DE FÊMEAS INGURGITADAS DE Rhipicephalus microplus SUBMETIDAS A UMA FORMULAÇÃO CONTENDO FIPRONIL E FLUAZURON

RESUMO

Rhipicephalus microplus (Canestrini, 1888) é um importante ectoparasito na criação de bovinos em regiões tropicais, subtropicais e temperadas no mundo. Esse carrapato atua na transmissão de patógenos, como Babesia bovis, Babesia bigemina e Anaplasma marginale, levando a um quadro clínico de moderado a grave. Outro prejuízo causado por R. microplus é a espoliação sanguínea, que leva a debilidade, anemia, perda de peso, podendo levar a óbito, em grandes infestações. Como o carrapato R. microplus representa importância médico veterinária, elevando os custos de produção de bovinos, torna-se importante a realização de controle, que é atualmente realizado quase que exclusivamente com a utilização de carrapaticidas organossintéticos. Atualmente, existem formulações comerciais disponíveis para controle de R. microplus com base na associação dos princípios ativos, fipronil e fluazuron, que tem sido amplamente utilizada. Contudo, não existem informações a respeito dos efeitos citotóxicos dessas moléculas sobre esse carrapato. Estudos sobre as alterações morfológicas causadas por esses produtos permitirão melhor compreensão do mecanismo de ação e toxicidade desses ingredientes ativos em diferentes órgãos. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar o potencial efeito histológico de uma formulação comercial, contendo fipronil e fluazuron sobre a biologia reprodutiva e ovários de fêmeas ingurgitadas de R. microplus. Para a realização do estudo, três bezerros foram infestados com aproximadamente 5.000 larvas nos dias -24, -21, -19, -17, -14, -12, -10, -7, -5 e -3, considerando o dia 0, o dia do tratamento. O tratamento consistiu na aplicação da formulação carrapaticida comercial contendo fipronil (1,25 %) e fluazuron (2,5%) (Tick Gard®- MSD Saúde Animal). Antes da aplicação da formulação carrapaticida, foram recuperadas 20 fêmeas ingurgitadas, naturalmente desprendidas dos bovinos, para formação do grupo controle. Após a aplicação da formulação comercial, foram coletadas fêmeas ingurgitadas naturalmente desprendidas dos animais nos dias +4, +12 e +20. Após a aplicação da formulação comercial, foram coletadas fêmeas ingurgitadas naturalmente desprendidas dos animais nos dias +5, +10 e +20 para acompanhamento da biologia reprodutiva e +4, +12 e +20 para avaliação da histologia dos ovários. As fêmeas coletadas para acompanhamento da biologia reprodutiva foram mantidas em câmara climatizada para oviposição, posteriormente, incubação desses ovos, enquanto as fêmeas utilizadas para as análises histológicas foram mantidas em câmara climatizada por 4 dias e após esse período, foram dissecadas. Os ovários foram retirados e armazenados em eppendorf com formalina tamponada 10%, onde permaneceram por 2 semanas. Posteriormente, os ovários foram desidratadas de forma seriada em etanol e incluídos em historesina de inclusão (Leica®) sendo armazenado durante duas semanas à 4º C. Após esse período os órgãos foram transferidos para moldes de silicone com resina de polimerização para formação dos blocos. Os blocos foram seccionados na espessura de 4.0 µm utilizando um micrótomo (Leica RM 2145) e distribuídos em lâminas para microscopia 26x76 mm com extremidade fosca. Os cortes foram corados com azul de toluidina (1%) e as lâminas foram avaliadas em microscópio para fotodocumentação. Na avaliação da biologia reprodutiva, foi observado que as fêmeas provenientes dos grupos tratados produziram uma menor quantidade de ovos (p<0,05) e esses ovos apresentaram uma menor viabilidade (p<0,5), quando comparados com o grupo controle. Todos os grupos tratados (G2 - dia+4; Grupo 3 - dia +12 e grupo 4 - +20) tiveram alterações morfológicas consideráveis. As alterações foram desorganização citoplasmática, degradação citoplasmática, formato irregular do oócito, vesícula germinativa com formato irregular, redução dos grânulos de vitelo, vacuolização dos grânulos de vitelo e rompimento do oócito. Também foi observado um menor número de oócitos em todos estágios de desenvolvimento (I, II, III, IV e V) e um maior número de oócitos indeterminados, nos ovários de fêmeas provenientes dos grupos tratados (p<0,05), quando comparados com o grupo controle. A partir desses resultados, é possível concluir que a formulação comercial contendo fipronil e fluazuron apresentou efeito citotóxico nos ovários de fêmeas ingurgitadas de R. microplus.

ABSTRACT

Rhipicephalus microplus is an important ectoparasite inside cattle breeding in tropical, subtropical and temperate region in the world. This tick is responsible for pathogens transmission, like Babesia bovis, Babesia bigemina and Anaplasma marginale, inducing a pathological condition that can lead to a moderate to severe clinical condition. Another harm caused by R. microplus is the large amount of blood sucking, which causes weakness, anemia, weight loss and death in case of large infestation. The R. microplus represents a great importance regarding to livestock cost, thus it is important control this ectoparasite which is done almost exclusively with chemical acaricide. Currently, there are commercial formulations for R. microplus control that contain, associated or not, fipronil and fluazuron. These substances are known to be widely used for decades, however there isn`t any information regarding cytotoxic effects of these molecules on ticks. Research on morphological changes caused by these two products allows a better understanding of how these active ingredients act in different tick organs. Thus, the objective of this study was to evaluate the reproductive biology and histological effects of a commercial formulation, containing fipronil and fluazuron on the ovary of R. microplus engorged females. Three calves were infested with approximately 5.000 larvae on days -24, -21, -19, -17, -14, -12, -10, -7, -5 and -3, considering day 0, the treatment day. The treatment consisted on the application of a commercial acaricidal formulation with fipronil (1,25 %) and fluazuron (2,5%) (Tick Gard®- MSD Saúde Animal). Before application of acaricidal formulation, 20 engorged females, naturally detached form the cattle, were recovered, to form the control group. After application of the commercial formulation, engorged females naturally detached from the animals were collected on days +5, +10 and +20 for reproductive biology monitoring and on days +4, +12 and +20 for ovaries histology evaluation. The females collected for reproductive biology monitoring were kept in a climatecontrolled chamber for oviposition, subsequently incubating these eggs, while the females used for histological analysis were kept in a climate-controlled chamber for 4 days and then dissected. The ovaries were dissected and stored in Eppendorf with buffered formalin 10%, which were remained for 2 weeks at 4°C. Subsequently, the ovaries were dehydrated serially in ethanol (70%, 80%, 90%, 95% and 100%) during 15 minutes interval, and included in inclusion historesin (Leica®) for another 2 weeks at 4º C. After this period, the organs were transferred to silicone molds with polymerization resin to form blocks. The blocks were sectioned at thickness of 4,0 µm, using a microtome (Leica RM 2145) and distributed on microscope slides 26x76 mm with a matte tip. The sections were stained with toluidine blue (1%). In reproductive biology evaluation, it was observed that females from the treated groups produced a smaller amount of eggs (p<0.05) and these eggs had a lower viability (p<0.5) when compared to the control group. In the histological analysis, many alterations were observed in the oocytes of females from all treated groups, including irregularly shaped oocyte, irregularly shaped germinal vesicle, yolk granules reduction, yok granules vacuolization and oocyte disruption. It was also observed a smaller number of oocytes in all stages of development (I, II, III, IV and V) and a greater number of indeterminate oocytes on ovaries of females from the treated groups (p<0.05), when compared with the control group. From these results, it is possible to conclude that the commercial formulation containing fipronil and fluazuron affected the reproductive biology of engorged females of R. microplus, and one of the mechanisms that possibly explains this effect is the cytotoxic action that the formulation with fipronil + fluazuron presented in the ovaries.