ISOLAMENTO DE AGENTES RIQUETSIAIS DE EQUINOS E CARRAPATOS DE VIDA LIVRE PROCEDENTES DE ÁREAS ENDÊMICAS PARA FEBRE MACULOSA BRASILEIRA NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

RESUMO

Doenças transmitidas por carrapatos representam um grande desafio dentro da medicina humana e veterinária. Dentre essas doenças destaca-se aquelas provocadas por agentes pertencentes a ordem Rickettsiales. Dentro desta ordem pode-se destacar os gêneros Anaplasma e Rickettsia. Ambos os agentes são transmitidos por carrapatos têm e são relevantes dentro da Saúde Única. Cultivo em linhagens de células a partir de carrapatos podem auxiliar no isolamento e diagnóstico desses hemoparasitos. Dentro desse contexto, este estudo teve como objetivo isolar por meio de cultivo celular hemoparasitos a partir de carrapatos e sangue de equinos procedentes de áreas endêmicas para Febre Maculosa no estado do Rio de Janeiro. Ao todo foram coletados 858 espécimes de carrapatos e sangue de 125 equinos. Os carrapatos foram divididos em diferentes pools de acordo com espécie e sexo, e preparados para o processamento do cultivo de células embrionárias de carrapatos. Em seguida, foram transferidos para frascos de cultivo contendo células embrionárias de Ixodes scapularis (ISE6). No terceiro dia de cultivo após as células começarem a se desprender do fundo do frasco de cultivo, foi observado através de microscopia óptica a partir de um esfregaço corado com panótipo rápido®, estruturas possuindo forma cocobacilar semelhantes as Rickettsia spp. Já a partir do sangue dos 125 equinos, apenas uma amostra apresentou inclusões sugestivas para Anaplasma spp. Tais amostras foram submetidos à técnica de PCR para confirmação da espécie, utilizando-se para a detecção de Rickettsia spp. os primers dos genes gltA, ompB e htrA e para a confirmação de Anaplasma spp. o primer que codifica o gene 23S. Apenas o pool contendo 3 machos e 3 fêmeas de Amblyomma dubitatum demonstrou resultado positivo paras os genes gltA e htrA e negativo para ompB. Tal amostra foi submetida ao método sanger para sequenciamento genético e seu resultado avaliado no programa BioEdit e comparada com as demais sequências já depositadas no GenBank, as quais deram uma similaridade de 97% para R. bellii. Em relação ao sangue do equino, confirmou-se o resultado positivo na PCR. A utilização da linhagem celular ISE6 se demonstrou bastante eficaz no isolamento de R. bellii e Anaplasma spp., sendo uma nova e promissora opção para cultivo de rickettsias.

ABSTRACT

Tick-borne diseases represent a major challenge within human and veterinary medicine. Among these diseases, those caused by agents belonging to the order of the Rickettsiales stand out. Within this order, the genera Anaplasma and Rickettsia can be highlighted. Both agents transmitted by ticks and of importance for Unique Health aiming at the concept of One Health. Cultivation in cell lines from ticks can assist in the isolation and diagnosis of these hemoparasites. This study aimed to isolate hemoparasites from ticks and blood of horses from areas endemic for Spotted Fever in the state of Rio de Janeiro by means of cell culture. In total, 865 specimens of ticks and blood were collected from 125 horses. Ticks were divided into different pools according to species and sex, identified and washed with sterilization protocol for crop processing. Then they were transferred to culture flasks containing embryonic cells of Ixodes scapularis (ISE6). On the third day of culture after the cells started to detach from the bottom of the culture flask, it was observed through optical microscopy from a smear stained with rapid panotype®, structures having a cocobacillary shape similar to Rickettsia spp. From the blood of the 125 horses, only one sample presented inclusions suggestive for Anaplasma spp. Such samples were submitted to the PCR technique to confirm the species, using for the detection of Rickettsia spp. the primers of the gltA, ompB and htrA genes and for the confirmation of Anaplasma spp. the primer that encodes the 23S gene. Only the pool containing 3 males and 3 females of Amblyomma dubitatum demonstrated positive results for the gltA and htrA genes and negative for ompB. The sample was then submitted to the sanger method for genetic sequencing and its result evaluated in the BioEdit program and compared with the other sequences already deposited in GenBank, which gave a 97% similarity to R. bellii. Regarding the horse's blood, the positive result in PCR was confirmed. The use of the ISE6 cell line is very effective in isolating R. bellii and other hemoparasites, being a promising new option for the cultivation of rickettsiae.