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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-220382

Resumo

O uso de biotécnicas da reprodução vem sendo utilizado como ferramenta para melhorar tanto a eficiência reprodutiva quanto maximizar o uso de animais geneticamente superiores. O Brasil é responsável por 29% da produção in vitro de embriões bovinos (PIVE) no mundo. Apesar da extensa utilização desta biotécnica, existem pontos críticos que limitam a sua eficiência. Fatores relacionados à qualidade de oócitos, o ambiente in vitro (mais exposto ao O2 atmosférico) e efeito touro (atributos espermáticos). Os atributos espermáticos vêm sendo relacionados com a fertilidade. Estudos têm relacionado o potencial de membrana mitocondrial (m) com o estresse oxidativo, sendo essa associação ora positiva ora negativa para a fecundação. Acredita-se que essa seja influenciada por outras características espermáticas associadas. Com isso, formulou-se a hipótese de que o m é um atributo dependente dos demais atributos relacionados à qualidade espermática, sendo que o Alto Perfil espermático quando associado com o Maior m, condiciona um ambiente mais ativo e oxidativo durante a fecundação in vitro (FIV). Esse ambiente mais exacerbado é deletério, diminuindo a taxa de blastocistos. No entanto, espermatozoides de Baixo Perfil associados a um Maior m, proporcionam um ambiente menos ativo e menos exacerbado, portanto maiores taxa de blastocistos. O objetivo deste trabalho foi avaliar como o m e os atributos relacionados ao perfil espermático interferem nas taxas de PIVE e na resposta antioxidante destes embriões. Portanto, foram realizadas manipulações de PIVE, análises dos parâmetros espermáticos por citometria de fluxo, cinética espermática (CASA), atividade mitocondrial (DAB), estresse oxidativo e detecção de óxido nítrico (NO.), análise de expressão de genes antioxidantes nos embriões. Além disso, foram realizadas análises de compostos associados a mitocôndria (ADT, ATP, NADH, FADH2) e peroxidação lipídica (4-HNE) por cromatografia líquida em amostras de espermatozoides e meio de FIV, respectivamente. Os resultados demonstram que apesar de ter sido observado relação de dependência do m com os demais atributos espermáticos, a relação encontrada entre o m e o Perfil espermático foi contrária a esperada na hipótese proposta. Ou seja, o Alto Perfil associado ao Maior m apresentou maiores taxas na PIVE. Assim como o Baixo Perfil com Maior m apresentou as piores taxas na PIVE. O Perfil espermático influenciou mais na PIVE do que a diferença de m. Quanto ao status oxidativo nos espermatozoides, não foram observadas diferenças entre os grupos estudados. As diferenças relacionadas ao metabolismo mitocondrial foram associadas à análise de DAB, e uma via compensatória foi observada no grupo de Menor m. Os baixos níveis de NO. detectados no meio de FIV foram associados com maiores índices de fertilidade in vitro. Para análise de expressão gênica, GPx4 foi mais expressa no grupo de Baixo Perfil espermático, demonstrando um desequilíbrio da resposta antioxidante no grupo de menor qualidade espermática. Não foi possível a detecção dos compostos relacionados ao metabolismo mitocondrial e peroxidação lipídica por cromatografia líquida. Portanto mais estudos, com metodologias mais sensíveis para essa detecção, devem ser realizados para que esses compostos sejam detectados e associados com o m, para melhor entendimento da função mitocondrial na PIVE.

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Reproductive biotechnologies have been used as a tool to improve both reproductive efficiency and maximize the use of genetically superior animals. Brazil is responsible for 29% of the in vitro production of bovine embryos (IVP) in the world. Despite the extensive use of this biotechnology, there are critical points that limit its efficiency. These factors relate to oocyte quality, in vitro environment (exposure to atmospheric O2) and the bull effect (sperm attributes). Sperm attributes have been associated with fertility. Studies have related the mitochondrial membrane potential (m) with oxidative stress, with this association being either positive or negative for fertilization. This is believed to be influenced by other associated sperm characteristics. Thus, it is hypothesized that m is an attribute dependent on the other attributes related to sperm quality, and the high sperm profile, when associated with the higher m, leads to a more active and oxidative environment during in vitro fertilization (IVF). This exacerbated environment is harmful, decreasing the rate of blastocyst formation. However, low profile sperm associated with a higher m provides a less active and less exacerbated environment, therefore resulting in higher rates of blastocyst formation. The objective of this work was to evaluate how m and attributes related to the sperm profile interfere in the PIVE rates and in the antioxidant response of these embryos. Therefore, IVP manipulations, analysis of sperm parameters by flow cytometry, sperm kinetics (CASA), mitochondrial activity (DAB), oxidative stress and detection of nitric oxide (NO.), and analysis of expression of antioxidant genes in embryos were performed. In addition, analyses of compounds associated with mitochondria (ADT, ATP, NADH, FADH2) and lipid peroxidation (4-HNE) were performed by liquid chromatography on samples of sperm and IVF medium, respectively. The results demonstrate that although a relationship of dependence of m with the other sperm attributes was observed, the relationship found between m and the sperm profile was contrary to what was expected in the proposed hypothesis. In other words, the high profile sperm associated with higher m resulted in higher rates of IVP. The low profile with the Higher m presented the worst rates of IVP. The sperm profile influenced IVP more than the m differences. Regarding the oxidative status in sperm, no differences were observed between the groups studied. Differences related to mitochondrial metabolism were associated with the analysis of DAB, and a compensatory pathway was observed in the group of lower m. Lower levels of NO detected in the IVF medium were associated with higher in vitro fertility rates. For gene expression analysis, Gpx4 had higher expression in the low sperm profile group, demonstrating an imbalance of the antioxidant response in the group with lower sperm quality. It was not possible to detect compounds related to mitochondrial metabolism and lipid peroxidation by liquid chromatography. Therefore, more studies, with more sensitive methodologies for this detection, should be carried out and associated with m, for a better understanding of mitochondrial function in IVP.

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