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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-220400

Resumo

Os objetivos do presente estudo foram: 1) avaliar os efeitos do etanol e do FSH sobre o desenvolvimento folicular, secreção de esteroides, expressão de mRNA (BAX, BCL2, AQP3, CX43, INHBA, HSD3B, KITLG, HSPA1A, CYP19A1 e FSHR), retomada da meiose e perfil metabólico de folículos secundários ovinos isolados cultivados in vitro por 18 dias (Fase 1); 2) investigar o efeito da adição de eugenol (10, 20 e 40 M), ácido ascórbico (50 g/mL) e anetol (300 g/mL) sobre a sobrevivência, ativação, diâmetro folicular e oocitário, produção de espécies reativas de oxigênio, capacidade antioxidante do meio após o cultivo in vitro por 7 dias de folículos pré-antrais caprinos inclusos no tecido ovariano (in situ) (Fase 2 - etapa 1); comparar a imunomarcação de calreticulina, trimetilação da histona (H3K4me3) e expressão de mRNA (CAT, KDM1AX1, KDM3A e ERP29) entre os tratamentos controle, Eugenol na concentração 40 M (melhor concentração de eugenol obtida na etapa anterior), ácido ascórbico e anetol (Fase 2 - etapa 2). Para o cultivo na forma isolada, os folículos ovarianos foram cultivados por 18 dias nos seguintes tratamentos: -MEM+ (controle cultivado), -MEM+ suplementado com 100 ng/mL de rbFSH (FSH recombinante bovino) ou 0.2%-v/v de Etanol (AL). Para o cultivo in situ, fragmentos ovarianos foram fixados imediatamente (tratamento controle não cultivado) ou distribuídos aleatoriamente e cultivados por 1 ou 7 dias nos seguintes tratamentos: -MEM+ (controle cultivado), -MEM+ suplementado com 50 g/mL de ácido ascórbico (AA), ou com 300 g/mL de anetol (ANE 300), ou diferentes concentrações de eugenol a 10 (EUG 10), 20 (EUG 20) ou 40 M (EUG 40). Os resultados da fase 1 demonstraram que o tratamento AL obteve uma maior produção de estradiol (P <0,05), maior percentagem de retomada da meiose (P = 0,057) e maiores níveis de RNAm para CYP19A1 e FSHR em relação ao controle. No tocante ao perfil metabólico, os níveis de alguns íons, que são provavelmente, aminoácidos, lipídios, um análogo do GMPc e um derivado do metabolismo do fosfoinositol, foram maiores (P<0,05) nos tratamentos AL e FSH do que no controle. Os resultados da fase 2-etapa 1 (cultivo in situ) demonstraram que, em geral, o EUG 40 melhorou a sobrevivência, ativação e crescimento folicular e oocitário em relação aos demais tratamentos testados (P<0,05). Já na fase 2-etapa 2, esse tratamento resultou em maiores taxas de viabilidade, reduziu a produção de ROS, aumentou a capacidade antioxidante do meio, reduziu a trimetilação da histona 3, aumentou a produção de calreticulina, a expressão de RNAm das KDMs e de ERP29 em relação ao meio controle. Em conclusão, o etanol aumentou a produção de estradiol e a retomada da meiose, bem como apresentou um perfil metabólico diferente do grupo controle após cultivo in vitro folículos pré-antrais ovinos isolados (fase 1). Além disso, a adição de eugenol na concentração de 40 M melhorou de forma eficiente a sobrevivência e o desenvolvimento de folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro e reduziu a produção de EROs (fase 2).

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The objectives of the present study were: 1) to evaluate the effects of ethanol and FSH on follicular development, steroid secretion, mRNA expression (BAX, BCL2, AQP3, CX43, INHBA, HSD3B, KITLG, HSPA1A, CYP19A1, and FSHR), resumption of meiosis, and metabolic profile of isolated ovine secondary follicles in vitro cultured for 18 days (Phase 1); 2) to investigate the effect of addition eugenol (10, 20 and 40 M), ascorbic acid (50 g/mL) and anethole (300 g/mL) on survival, activation, follicular and oocyte diameter, production of reactive species of oxygen, the antioxidant capacity of the medium after in vitro culture for 7 days of goat preantral follicles enclosed in the ovarian tissue (in situ) (Phase 2 - step 1); to compare calreticulin, histone methylation (H3K4me3) immunostaining and mRNA expression for CAT, KDM1AX1, KDM3A, and ERP29 among control, 40 M Eugenol (best eugenol concentration obtained in the phase 2- step 1), ascorbic acid and anethole treatments (Phase 2 - step 2). With regard to the in vitro follicle culture in the isolated form (phase 1, ovarian follicles were cultured for 18 days in the following treatments: -MEM+ (cultured control), -MEM+ supplemented with 100 ng/mL of rbFSH (recombinant bovine FSH) or 0.2%-v/v of Ethanol (AL). In the phase 2, ovarian fragments were either fixed immediately (non-cultured control treatment) or randomly distributed and cultured for 1 or 7 days in the following treatments: -MEM+ (cultured control), -MEM+ supplemented with 50 g/mL acid ascorbic (AA), or with 300 g/mL of anethole (ANE 300), or different concentrations of eugenol at 10 (EUG 10), 20 (EUG 20) or 40 M (EUG 40). The results of phase 1 demonstrated that the AL treatment had higher estradiol production (P < 0.05), higher percentage of meiosis resumption (P = 0.057), and mRNA levels for CYP19A1 and FSHR compared to the control. Regarding the metabolic profile, the levels of some ions, which are probably amino acids, lipids, a cGMP analog, and a derivative of phosphoinositol metabolism, were higher (P<0.05) in AL and FSH treatments than in the control. The results of phase 2-step 1 (in situ culture) showed that, in general, EUG 40 improved the survival, activation, and follicular and oocyte growth compared to the other tested treatments (P<0.05). In the phase 2-step 2, EUG 40 treatment resulted in higher viability rate, reduced ROS production, increased the antioxidant capacity of the medium, reduced histone 3 methylation expression, increased calreticulin expression, the mRNA levels for KDM1AX1, KDM3A, and ERP29 when compared to control. In conclusion, ethanol increased estradiol production and meiosis resumption, as well as presented a different metabolic profile than the control group after in vitro culture of isolated ovine preantral follicles (phase 1). Furthermore,the addition of eugenol at 40 M improved significantly the survival and development of in vitro cultured goat preantral follicles and reduced the production of ROS (phase 2).

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