GENETIC VARIABILITY OF NEW BRAZILIAN PCV2D STRAINS AND THEIR RELATION TO COMMERCIAL VACCINES

RESUMO

No presente estudo 246 amostras clínicas oriundas de granjas de suínos comerciais nas regiões sul, sudeste e centr-oeste do Brasil, previamente vacinadas contra PCV2 e que apresentavam sinais clínicos compatíveis com PCVD foram submetidas para genotipagem de PCV2. O tipo de material enviado para diagnóstico foram amostras de fluido oral, soro e pool de órgãos linfoides. Das amostras analisadas, 106 (43.09% - 106/246) foram genotipadas, sendo 75.47% (80/106) identificadas como PCV2d e 22.64% (24/106) identificadas como PCV2b. Em 2/106 (1.89%) amostras foram verificadas co-infecção de PCV2b e PCV2d. Não houve detecção do genótipo PCV2a nas amostras analisadas. Dentre as amostras clínicas analisadas, o fluido oral obteve um maior número de amostras genotipadas (40/106-37.74%), seguido de pool de órgãos linfóides e soro, com o mesmo número de amostras genotipadas (33/106- 31.13%). Adicionalmente, 51 amostras clínicas brasileiras coletadas em 2019 foram enviadas para sequenciamento genético do gene ORF2, que codifica a proteína do capsídeo viral (Cap). Destas, 25 apresentaram boa qualidade para análise, sendo 8 genotipadas como PCV2b e 17 como PCV2d, confirmando que no Brasil, como descrito mundialmente, houve o aumento do genótipo PCV2d. Para analisar a distribuição temporal dos genótipos e flutuação mundial dos genótipos desde 1993 à 2019, 3,544 sequencias disponíveis no GenBank foram analisadas, demonstrando um considerável aumento do genótipo PCV2d a partir de 2006, sendo hoje, o genótipo mais prevalente no mundo. Para estimar a variabilidade da Cap protein de nossas sequencias de PCV2d, comparamos nossas amostras com outras 1,300 sequencias de PCV2d disponíveis no GenBank. Com o objetivo de avaliar a possível pressão vacinal sobre o o genótipo PCV2d, separamos as sequencias em 4 grupos (1) Pre vacinação (PreVacD) - sequencias de amostras coletadas antes de 2006; (2) Pós vacinação (PosVacD) - sequencias de amostras coletadas entre 2007 e 2020; (3) sequencias de suínos selvagens ou de vida livre(WboarD) que não sofreram pressão vacinal; e (4) nossas sequencias de PCV2d (TestD), analisadas no presente estudo.. Devido às possíveis falhas vacinais observadas nas granjas de suínos comerciais no Brasil, as amostras de PCV2d sequenciadas no presente estudo foram comparadas com as sequencias da ORF2 disponíveis de três vacinas comercias utilizadas no Brasil, uma contendo o genótipo PCV2b e duas contendo o genótipo PCV2a. Grande parte dos resíduos de aminoácidos que se encontram dentro de regiões de epítopo são conservadas, sugerindo uma boa reação cruzada entre as amostras vacinais e as amostras de PCV2d analisadas. Contudo, em alguns resíduos de aminoácidos em sítios antigênicos, essencias para ligação de anticorpos e, consequentemente, neutralização viral, foram detectadas mutações entre as sequencias de PCV2d e as sequencias vacinais. Este resultado sugere que estas mutações possam ter importancia em relação à resposta. Porém, mais estudos devem ser realizados para elucidar essas questões, principalmente a implementação de processos de vigilância de genótipos de Circovirus suínos tipo 2 circulantes no Brasil.

ABSTRACT

In the present study, 246 clinical samples from commercial pig farms located in the south, southeast and central-west regions of Brazil previously vaccinated against PCV2 and showing clinical signs compatible with PCVD were submitted for PCV2 genotyping. The type of material sent for diagnosis were samples of oral fluid, serum and lymphoid organs pool. Of the analyzed samples, 106 (43.09% - 106/246) were genotyped, with 75.47% (80/106) identified as PCV2d and 22.64% (24/106) as PCV2b. In 2/106 (1.89%) samples, coinfection of PCV2b and PCV2d was observed. There was no detection of the PCV2a genotype in the analyzed samples. Among the analyzed clinical samples, oral fluid obtained the greater number of genotyped samples (40/106- 37.74%), followed by pool of lymphoid organs and serum, with the same number of genotyped samples (33/106-31.13%) . Additionally, 51 Brazilian clinical samples collected in 2019 were sent for genetic sequencing of the ORF2 gene, widely used for genomic/protein analysis, which encodes for the viral capsid protein (Cap). Of these, 25 had good quality for analysis, and 8 were genotyped as PCV2b and 17 as PCV2d, corroborating many other publications around the world that demonstrated the increase of the PCV2d genotype. To analyze the temporal distribution of genotypes and fluctuation of genotypes from 1993 to 2019 worldwide, 3,544 sequences available in GenBank were analyzed, demonstrating a considerable increase in the PCV2d genotype since 2006, today the most prevalent genotype in the world. To estimate the Cap protein variability of our PCV2d sequences, our results were compared to other 1,300 PCV2d sequences available in GenBank. In order to assess the possible pressure of the vaccine against the PCV2d genotype population infection, four groups of samples were defined (1) Prevaccination (PreVacD) - sequences from samples collected before 2006; (2) Post-vaccination (PosVacD) - sequences of samples collected between 2007 and 2020; (3) sequences from wild or feral pigs (WboarD) that were not vaccinated, and (4) our PCV2d sequences (TestD) analyzed in the present study. Due to possible vaccine failures observed in commercial pig farms in Brazil, the PCV2d sequenced samples in the present study were compared to the ORF2 amino acid sequences available from three commercial vaccines used in Brazil, one containing the PCV2b genotype and 2 containing the PCV2a genotype. Most of the amino acid residues found within epitope regions were conserved, suggesting a good cross-reaction between vaccines and the analyzed PCV2d samples. However, in some amino acid residues in antigenic sites essential for antibody binding and consequently viral neutralization, mutations were detected in PCV2d sequences and in vaccine sequences. This result may suggest that these mutations might be involved in the vaccine immune response. However, further studies must be carried out to elucidate these aspects, especially the implementation of surveillance processes of Porcine Circovirus type 2 genotypes circulating in Brazil.