Utilização de exossomos para melhoria da viabilidade de células tronco derivadas da membrana amniótica canina

RESUMO

SCASSIOTTI, Rodrigo Ferreira. Utilização de exossomos para melhoria da viabilidade de células tronco derivadas da membrana amniótica canina. 52 f. 2021. Dissertação (Mestrado em Ciências) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2021. Estudar o processo de comunicação e diferenciação celular é fundamental para o melhor entendimento do organismo como um todo. Para tanto, se faz necessário entender a interação entre células que ocorre por meio da comunicação e transporte de proteínas, lipídeos e materiais genéticos, realizada através da secreção de vesículas extracelulares, como os exossomos. Assim, este trabalho tem por principal objetivo avaliar o efeito da suplementação basal de exossomos em culturas celulares com células-tronco mesenquimais (CTM) amnióticas canina. Foi realizado o isolamento de células derivadas do tecido amniótico de cães, cultura e cultivo das mesmas com meio DMEM suplementado por soro fetal bovino, antibiótico, antifúngico e aminoácidos essenciais, até que atingissem de 80 a 90% de confluência, quando então era realizada nova passagem celular. Também foi realizada a determinação de curva de crescimento. Posteriormente, as células foram caracterizadas e diferenciadas em linhagem adipogênica, condrogênica e osteogênica. Realizou-se o isolamento de vesículas extracelulares através de protocolo de ultracentrifugação e caracterização das mesmas por Nanosight. Exossomos foram suplementados a culturas basais de CTM, padronizadas em placas de 12 poços com concentração de 3x104 células por poço, em triplicata técnica e biológica, para avaliação de alterações em padrões de curva de crescimento, determinando-se assim sua capacidade de melhoria em viabilidade celular em passagens naturalmente ineficientes. Os resultados demonstraram um aumento de 15 a 20% na taxa de expansão dos cultivos suplementados com vesículas extraídas em passagens P1 e P2, quando comparadas ao grupo controle, bem como uma maior resistência ao processo de apoptose celular. Tal resultado foi corroborado por análise estatística através de Teste de Dunnett, com p0.5, comprovando a correlação positiva entre a suplementação e taxa de expansão, indicando, desta forma, não só a importância dos exossomos no processo de comunicação celular, mas também a viabilidade de um protocolo de suplementação de cultivos para fins terapêuticos.

ABSTRACT

SCASSIOTTI, Rodrigo Ferreira. Use of Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes to improve the viability of canine amniotic stem cells 52 f. 2021. Dissertação (Mestrado em Ciências) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2021. Studying the cellular intercommunication and differentiation process is crucial for a better understanding of the organism as a whole. Therefore, it is necessary to understand the interaction between cells that occurs through the communication and transport of proteins, lipids and genetic materials, carried out through the secretion of extracellular vesicles, such as exosomes. This study aims to evaluate the effect of basal supplementation of exosomes in cell cultures with canine amniotic mesenchymal stem cells (MSC). Mesenchymal Stem Cells derived from amniotic tissue of dogs were isolated and cultivated in cultures suplemented with DMEM medium, fetal bovine serum, antibiotics, antifungal and essential amino acids, until performing cellular passage at 80-90% confluence. The growth curve was determined, presenting peak cell growth in second passage followed by decline until the fifth passage. The cells were then characterized and differentiated into adipogenic, chondrogenic and osteogenic lineages. Extracellular vesicles were isolated using an ultracentrifugation protocol and characterized by Nanosight. Exosomes were supplemented to MSC cultures medium, standardized in 12-well plates with a concentration of 3x104 cells per well, in technical and biological triplicate, to evaluate changes in growth curve patterns, thus determining their ability to improve cellular viability in naturally inefficient passages. The results showed a 15 to 20% increase in the expansion rate of cultures supplemented with vesicles extracted in P1 and P2 passages, when compared to the control group, as well as a greater resistance to the cellular apoptosis process. This result was corroborated by statistical analysis using the Dunnett Test, with p0.5, proving the positive correlation between supplementation and expansion rate, thus indicating not only the importance of exosomes in the cell communication process, but also the feasibility of a culture supplementation protocol for therapeutic purposes.