Utilização da LAMP (amplificação isotermal mediada por Loop) como ferramenta para determinação do sexo na espécie eqüina

RESUMO

A sexagem fetal em equinos representa uma abordagem de grande importância para a equideocultura. Através da determinação do sexo do feto, tomadas de decisões por parte do produtor podem ser realizadas quanto ao concepto, como, a manutenção do potro no plantel, venda e determinação do valor da venda, utilização para determinada atividade, entre outros. Algumas técnicas já são utilizadas com essa finalidade, como ultrassonografia, aplicações moleculares, bioquímicas e citogenéticas, porém, o longo tempo empregado nas técnicas, a necessidade de mão-de-obra treinada, e a utilização de equipamentos laboratoriais caros, oneram e restringem a sua realização. O objetivo deste trabalho é desenvolver um protocolo baseado na técnica de LAMP (Amplificação Isoretmal Mediada por Loop) para sexagem de equinos que possa ser aplicada para a sexagem fetal utilizando o DNA circulante no sangue materno. Para isso, foram realizados estudos para a identificação de genes macho específicos, que foram determinantes para o desenvolvimento do trabalho in silico, com desenhos e análise de primers e na otimização das técnicas da Reação em cadeia da Polimerase (PCR) e LAMP. Foi coletado sangue de 10 cavalos e 10 éguas e realizada ainda a quantificação e diluição do DNA obtido para a determinação da quantidade mínima de DNA necessário para obtenção de resultados esperados. Através dessa quantificação a menor concentração adotada para a otimização da etapa colorimétrica na técnica de LAMP foi de 0,004 ng/L de DNA. Após a otimização, foi coletado sangue venoso de 13 éguas prenhas, nos tempos de 30, 60, 90 dias de gestação, e, através da extração de DNA do plasma sanguíneo, foi realizado o teste de diagnóstico do sexo dos fetos por LAMP. Como resultados das otimizações da PCR e LAMP foi verificado que é possível diagnosticar o sexo dos equinos através dos genes escolhidos. No entanto, não se obteve resultado quanto a sexagem fetal utilizando o sangue materno até os 90 dias de gestação. Assim, considera-se a necessidade de realização de testes de diagnóstico fetal com a ampliação do período de coleta do sangue materno, quanto a idade gestacional das éguas, no terço médio e final da gestação.

ABSTRACT

The equine fetal sexing represents a great important subject for an equine culture. Through the fetal gender determination, producer decisions may be taken regarding the conceptus, as a foal maintenance in a squad, sale and sale price determination, assignment for a given task, and others. Some techniques have already been used for this goal, as ultrasound, molecular, biochemical and cytogenetics applications, however, the long time period required for each technique of those, specialized labor skills needs and expensive laboratory equipment burden this realization. The aim of this study is to develop an equine sexing protocol based on LAMP technique allowed to be applied to fetal sexing using the DNA that flows into maternal blood. Therefore, studies were performed to identify specific male genes that were determinants to in silico work development, with drawings and primers analysis and optimization of Polymerase Chain Reaction (PCR) and LAMP technique. Blood of 10 male and 10 female horses were collected and the quantification and dilution of DNA obtained were done to determinate the minimum amount DNA required to expected results. Through this quantification, the least adopted concentration to the optimization of colorimetric step in a LAMP technique was 0,004 ng/L of DNA. After optimization, venous blood of 13 male inseminated horses were collected, at times of 30, 60, 90 days after and, through the DNA plasma blood extraction, the fetal gender diagnostic test were made by LAMP. As an optimization of PCR and LAMP results were verified that is possible the equine sex diagnosis by the choose genes. However, results about fetal sexing were no obtained using maternal blood until 90 days of pregnancy. So that, the necessity carrying out fetal diagnostic tests with the extension of the maternal blood collection period regarding the gestational age of the mares, for the middle and final third of gestation.